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    Etichettatura e rilevamento delle modifiche dell'RNA

    I principali autori dello studio (da sinistra):il biologo molecolare Dr. Sebastian Leidel, biochimica Katja Hartstock (autore principale), il biologo molecolare Benedikt Nilges e il biochimico Professor Andrea Rentmeister. Credito:WWU/E. Wibberg

    Cosa succede in una cellula quando l'informazione genetica viene tradotta in proteine? Per studiare questo processo, ricercatori studiano una particolare biomolecola all'interno della cellula:l'acido ribonucleico messaggero, mRNA in breve. Questa biomolecola svolge un ruolo importante in tutti i processi cellulari ed è anche al centro della ricerca congiunta condotta da due gruppi presso il Cluster di eccellenza Cells-in-Motion dell'Università di Münster. Uno dei gruppi è composto da biochimici ed è diretto dal Prof. Andrea Rentmeister; l'altro è formato da biologi molecolari ed è guidato dal dott. Sebastian Leidel.

    Nella loro collaborazione interdisciplinare, i ricercatori sono riusciti per la prima volta a etichettare chemio-enzimaticamente un importante cambiamento nell'RNA messaggero, la cosiddetta modifica m6A, e successivamente a rilevarlo mediante moderni metodi di biologia molecolare. "Questo nuovo approccio ci consente di individuare le modifiche nell'mRNA con un grado di accuratezza mai visto prima, "dice Andrea Rentmeister, un professore del Cluster of Excellence che ha guidato lo studio. Sapere dove e in che misura si verificano le modifiche di m6A potrebbe aiutare i ricercatori a comprendere questa modifica nei processi fisiologici e patologici. Lo studio è stato pubblicato su Angewandte Chemie (edizione internazionale) rivista.

    L'informazione genetica del DNA viene trascritta nell'RNA messaggero in un processo noto come trascrizione. A seguito della trascrizione, L'mRNA trasporta l'informazione genetica dal nucleo cellulare al citoplasma. Là, serve come guida per la produzione di proteine. Le proteine ​​sono i cavalli da lavoro che svolgono tutti i compiti cellulari.

    Come il DNA a doppio filamento, L'RNA a singolo filamento è costituito da una catena di cosiddetti nucleotidi. Nell'RNA, però, ci sono anche molti cambiamenti chimici a questi nucleotidi, noti come modificazioni dell'RNA. Queste modifiche si verificano dopo che l'informazione genetica è stata letta. Nel processo, semplici disposizioni atomiche, i gruppi metilici, sono attaccati ai nucleotidi. "Una modifica attualmente oggetto di accesi dibattiti è la N6-metiladenosina, noto come m6A in breve, " dice Andrea Rentmeister. Questa modifica è molto interessante perché sembra essere responsabile di una serie di processi biologici tra cui l'orologio circadiano. Sembra anche avere un ruolo nei processi patologici, per esempio in alcune forme di cancro o nelle infezioni virali.

    I biochimici hanno etichettato le modificazioni dell'RNA in modo chemio-enzimatico

    Al fine di ottenere una migliore comprensione di m6A, i ricercatori hanno cercato di scoprire dove esattamente nell'mRNA si trovava la modifica. Per etichettare le molecole, i biologi usano spesso anticorpi che si attaccano ad esso. Questo metodo ha i suoi limiti, però; gli anticorpi possono legarsi non solo alle modificazioni dell'mRNA, ma anche ai nucleotidi vicini. Ciò rende difficile individuare con precisione le modifiche. "Ora volevamo effettuare l'etichettatura con un approccio chimico, " spiega Andrea Rentmeister. Per la prima volta, lei e il suo team hanno usato gruppi propargil, un residuo idrocarburico leggermente più lungo.

    I ricercatori hanno accoppiato i gruppi propargil al cosubstrato dell'enzima, e combinato tutti e tre i componenti con molecole di mRNA nella provetta. Nella sua struttura chimica, propargil è simile a una molecola naturale legata da una metiltransferasi. Le metiltransferasi da parte loro sono enzimi responsabili della modifica dell'mRNA. Così, le metiltransferasi erano in grado di trasferire il gruppo propargil all'RNA. Utilizzando la cosiddetta chimica dei clic, gli scienziati sono stati in grado di isolare e purificare l'RNA con gruppi propargilici.

    I biologi molecolari hanno rilevato modifiche dell'RNA utilizzando il sequenziamento di nuova generazione

    Al fine di rilevare le modifiche specificamente etichettate, i ricercatori hanno utilizzato un enzima speciale per trascrivere l'mRNA nel DNA. Il filamento di DNA risultante è una copia dell'RNA precedente e può essere studiato utilizzando metodi di biologia molecolare. I ricercatori hanno sequenziato questo filamento di DNA appena sintetizzato, lettura delle sequenze dei nucleotidi. Hanno usato il sequenziamento di nuova generazione, che ha permesso loro di determinare le sequenze dei nucleotidi in modo estremamente efficiente. "Questo metodo ci permette di analizzare migliaia di sequenze in parallelo, " spiega Sebastian Leidel.

    Poiché i ricercatori avevano etichettato le modifiche con i gruppi propargil, gli enzimi necessari per la riscrittura dell'RNA arrestato. Di conseguenza, non sono riusciti a trascrivere l'RNA in DNA. "Gli enzimi hanno cessato qualsiasi attività nei siti etichettati e hanno generato una sorta di segnale di arresto, "dice Katja Hartstock, un chimico e autore principale della storia. I ricercatori sono stati in grado di determinare questi segnali di arresto durante il sequenziamento, il che significava che potevano rilevare i siti in cui si è verificata la modifica dell'mRNA.

    Dopo i primi esperimenti in provetta, i ricercatori hanno applicato il loro nuovo metodo in una coltura di cellule epiteliali umane, le cellule HeLa. I ricercatori hanno alimentato le cellule con un cosiddetto precursore di amminoacidi marcato con propargil, che le cellule "mangiarono, " e successivamente avviata l'etichettatura. Come già stabilito in provetta, i gruppi propargil si sono attaccati all'RNA con l'aiuto di metiltransferasi e hanno permesso la rilevazione dei siti di modifica dell'mRNA mediante sequenziamento di nuova generazione.

    Il prossimo passo che i ricercatori vogliono fare è applicare il loro metodo agli organismi viventi per studiare il significato della modifica all'interno del loro sviluppo. I pesci zebra sono adatti a questo scopo poiché si sviluppano molto velocemente e le modifiche vengono quindi trascritte più velocemente e vengono anche rimosse più velocemente.


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