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    Assemblaggio di molecole fluttuanti nella membrana cellulare artificiale

    Se sono domini a doppio strato lipidico ricchi di lipidi modificati da polietilenglicole (PEG). (A) Immagine a fluorescenza, (B) topografia AFM a modulazione di ampiezza (AM), e (C) topografia AFM a modulazione di frequenza (FM). Credito:Toyohashi University of Technology

    Lipidi e proteine ​​di membrana presenti nelle membrane cellulari, che si trovano nello strato più esterno delle cellule, sono responsabili del riconoscimento degli ambienti extracellulari e del trasferimento di tali informazioni all'interno della cellula. A causa della loro profonda relazione con l'infezione batterica e virale e la risposta immunologica e la trasmissione neurale, sono importanti temi di ricerca nei campi della biologia, medicina e sviluppo di farmaci. Nel processo di reazione sia del riconoscimento esterno che del trasferimento del segnale, la formazione di aggregati bidimensionali di lipidi con ingombranti gruppi idrofili, come catene di zucchero o anelli di inositolo, nelle membrane cellulari sono considerati necessari. Piccoli aggregati fino a 10 molecole sono chiamati cluster, mentre gli aggregati con più molecole e un'ulteriore crescita sono chiamati domini.

    I lipidi sono molecole anfifiliche derivate da organismi, e hanno proprietà sia idrofile che idrofobiche all'interno delle loro molecole. Molti studi passati hanno dimostrato che le interazioni nella regione idrofobica, come la transizione di fase e la miscibilità delle catene di idrocarburi, giocano un ruolo importante nella formazione di domini nelle membrane a doppio strato lipidico. D'altra parte, le interazioni nelle regioni idrofile dei lipidi non sono state ampiamente studiate, con molti fattori ancora poco chiari. Le interazioni si complicano a causa della repulsione che si verifica attraverso la fluttuazione delle proprietà idrofile nell'acqua, in particolare nelle regioni idrofile voluminose come le catene di zucchero. La repulsione causata da tale fluttuazione influisce anche sulle misurazioni tramite microscopia a forza atomica (AFM) in grado di rilevare anche la più piccola quantità di forza.

    Un team di ricerca guidato da Ryugo Tero, Professore Associato presso la Toyohashi University of Technology, ha utilizzato la microscopia a fluorescenza e l'AFM per esaminare in dettaglio le membrane artificiali a doppio strato lipidico contenenti lipidi modificati dal polimero idrofilo, glicole polietilenico (PEG) (Figura 1). I risultati hanno rivelato che due tipi di aggregati, cluster e domini, forma a seconda della concentrazione di lipidi modificati con PEG, e che non c'è quasi fluidità nei domini che appaiono a causa dell'alta concentrazione. Questi aggregati non si formano attraverso l'interazione della regione idrofobica dei lipidi, ma attraverso l'interazione della loro regione idrofila. interessante, quando osservato con AFM, i domini lipidici modificati con PEG che avrebbero dovuto essere voluminosi, sono stati osservati a un livello inferiore rispetto all'ambiente circostante (Figura 1B). Il Professore Associato Tero ha realizzato un esperimento congiunto con il Professor Takeshi Fukuma nell'Università di Kanazawa riguardo alle ragioni di ciò. Utilizzando la modulazione di frequenza AFM (FM-AFM), e controllando accuratamente la forza tra il campione e la sonda, sono stati in grado di osservare il dominio lipidico modificato dal PEG a un livello superiore rispetto all'area della membrana lipidica, senza l'applicazione di alcuna forza (Figura 1C). Poiché le repulsioni cambieranno a causa della fluttuazione delle catene polimeriche idrofile dipendenti dalla forza applicata, è stato riscontrato che in generale, un'immagine inversa della vera struttura tridimensionale appare inevitabilmente alle condizioni per l'osservazione AFM (AM-AFM) di modulazione di ampiezza.

    Topografia forza-dipendente del dominio ricco di lipidi PEG. Credito:Toyohashi University of Technology

    "Al fine di stabilire un metodo sperimentale per esaminare lo stato e la funzione aggregati dei glicolipidi, abbiamo utilizzato lipidi modificati con PEG che sono facili da ottenere fin dall'inizio. Abbiamo faticato a trovare le condizioni più adatte per la preparazione del campione e l'osservazione AFM della membrana a doppio strato lipidico contenente lipidi modificati con PEG. I risultati differivano notevolmente rispetto alle aspettative, soprattutto per il fatto che le aree rientrate sono cresciute con l'aumento della concentrazione di lipidi modificati con PEG. Pensando che potrebbe esserci stato un errore, abbiamo ripetuto l'esperimento e ne abbiamo confermato la riproducibilità. Intuitivamente, può sembrare improbabile che la regione con molecole voluminose appaia più bassa con AFM, ma quando si considerano lo stato assemblato del polimero e i principi di base dell'AFM, questo è in realtà molto ragionevole. Quando le proprietà concavo-convesse della superficie si sono invertite dopo il passaggio a FM-AFM, l'esperimento congiunto con l'Università di Kanazawa ha raggiunto il suo apice e abbiamo gridato 'Eureka!'" Così spiega l'autore principale, Yasuhiro Kakimoto, attualmente in corso di Dottorato (Iscritto al Programma per Leading Graduate School organizzato dal Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Gli sport, Scienze e tecnologia).

    Il capogruppo di ricerca, Il Professore Associato Ryugo Tero ha dichiarato:"Per comprendere le funzioni delle biomolecole a livello molecolare, è fondamentale comprendere l'aspetto delle molecole morbide, come lipidi e proteine, fluttuante nell'acqua. Infatti, alcune prove da esperimenti contenenti molti glicolipidi osservati a un livello inferiore con AM-AFM sono state ottenute per circa 10 anni in diversi sistemi. Sebbene la repulsione dovuta alla fluttuazione delle regioni idrofile fosse solo un'ipotesi, questo studio ne ha confermato la validità. I risultati cruciali in questo studio sono stati i risultati ottenuti utilizzando lo strumento FM-AFM all'avanguardia del professor Fukuma (Figura 2), che portano a questa ricerca congiunta che ottiene risultati magnifici."

    È stato scoperto che il principio della formazione del dominio dovuto alle interazioni con le catene polimeriche idrofile identificate come risultato di questa ricerca condivide punti in comune con i glicolipidi nella membrana cellulare. Il nostro gruppo di ricerca è dell'opinione che questo principio aiuterà nella comprensione del meccanismo di riconoscimento cellulare e di trasferimento del segnale correlato allo stato aggregato dei glicolipidi e delle proteine ​​di membrana. Per di più, i risultati degli esperimenti, in cui oggetti ingombranti possono apparire affondati a seconda delle condizioni, sono vitali per molti ricercatori che analizzano le molecole biologiche sott'acqua attraverso la microscopia a forza atomica. Inoltre, I PEG hanno l'effetto di sopprimere gli adsorbimenti non specifici come proteine, eccetera., e può essere utilizzato anche nelle interfacce biologiche e nella somministrazione di farmaci. Si prevede che la formazione e la risposta alla forza di cluster e domini ricchi di PEG abbiano un effetto pervasivo anche in questi campi.


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