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    Individuazione di biomolecole con precisione nanometrica

    L'accuratezza dei nanometri nella microscopia di localizzazione a fluorescenza a campo lontano di due fluorofori legati a entrambe le estremità di 30 coppie di basi di una molecola di DNA a doppio filamento (dsDNA) è stata dimostrata utilizzando la microscopia a crio-fluorescenza. Credito:Tokyo Tech

    Sarebbe impossibile comprendere la vita senza avere una solida conoscenza delle interazioni microscopiche tra le molecole che si verificano all'interno e intorno alle cellule. I microscopi sono e sono stati uno strumento prezioso per i ricercatori in questo senso, ed esistono molti diversi tipi di microscopi e tecniche di microscopia. Di conseguenza, queste diverse tecniche hanno scopi diversi e presentano vantaggi e svantaggi.

    In biologia e medicina in particolare, i ricercatori stanno cercando tecniche di microscopia per ottenere informazioni tridimensionali sulla disposizione e l'orientamento delle singole molecole all'interno delle cellule su scala nanometrica. Un approccio plausibile per raggiungere questo obiettivo è criogenico (cioè, a temperature estremamente basse) tomografia elettronica. Però, questa tecnica non può essere utilizzata per osservare l'interno delle cellule ed è limitata a fette sottili estratte dalla cellula campione, che non è utile quanto essere in grado di localizzare direttamente le molecole all'interno di cellule intatte.

    Per ottenere misurazioni più utili, la luce visibile può essere utilizzata per illuminare campioni speciali nella cosiddetta microscopia a fluorescenza. Quando si utilizza questo metodo, le molecole bersaglio sono etichettate con "fluorofori, " che sono minuscole molecole che assorbono energia dalla luce di un colore specifico (frequenza) e poi la riemettono illuminandosi. Sebbene questo approccio sia stato segnalato per essere utile per localizzare singoli fluorofori nel piano XY (una superficie piana), la localizzazione tridimensionale significativa delle biomolecole richiede una maggiore precisione nella direzione Z, o profondità, rispetto a quanto attualmente possibile.

    Ecco perché un team di ricercatori della Tokyo Tech, tra cui il Dr. Satoru Fujiyoshi, L'Università di Nagoya e l'Università di Kyoto hanno approfondito la microscopia a crio-fluorescenza per ottenere informazioni sulle fonti di errore in tali misurazioni e sui modi per correggerle. I campioni che hanno usato erano molecole di DNA di lunghezza nota (10 nanometri) con diversi fluorofori su ciascuna estremità.

    Inizialmente, dopo aver ottenuto le immagini di entrambi i fluorofori e aver determinato la distanza tra loro per vedere se corrispondeva alla lunghezza delle molecole di DNA, c'era un errore significativo nelle loro misurazioni. Ciò è stato causato dall'orientamento del fluoroforo nello spazio 3-D, che non sempre era perfettamente allineato con il piano di osservazione ed era invece inclinato o inclinato. Questo è noto come "effetto di orientamento del dipolo" ed è un grave fattore limitante nella microscopia a fluorescenza. L'effetto è legato alla scarsa precisione di misura nella direzione Z e, come hanno dimostrato i ricercatori, può essere corretto.

    È qui che entra in gioco la misurazione in condizioni criogeniche. Le molecole vengono immediatamente congelate sul posto, consentendo misurazioni 3D ad alta precisione che contrastano l'effetto di orientamento del dipolo. La precisione (riproducibilità) con cui sono stati localizzati i fluorofori era di ±1 nanometro sul piano di osservazione e ±11 nanometri nella direzione Z, o profondità, che è senza precedenti per questo tipo di microscopia. Attraverso queste correzioni, i ricercatori sono riusciti a localizzare i fluorofori sulle molecole di DNA con una precisione nanometrica (accordo con il vero valore). "Correggendo l'effetto di orientamento del dipolo, siamo riusciti a migliorare l'accuratezza della localizzazione di questi fluorofori fino al livello nanometrico, " commenta il dottor Fujiyoshi.

    Il team di ricerca continuerà il proprio lavoro su questo approccio utilizzando una coppia di fluorofori specificamente progettati per condizioni criogeniche, con cui si aspettano di ottenere risultati ancora migliori. "Questo tipo di microscopia a crio-fluorescenza contribuirà a rivelare i meccanismi e i processi all'interno delle cellule a livello molecolare, "dice il dottor Fujiyoshi.


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