PB430 è costituito da uno scheletro Ï€-coniugato completamente fuso ad anello con un'unità P-ossido di fosforo che accetta elettroni, che è responsabile della sua elevata fotostabilità. L'acido carbossilico della molecola può essere convertito nell'estere N-idrossilsuccinimidil (NHS), che permette la coniugazione a biomolecole. I gruppi solfonato garantiscono un'elevata solubilità della molecola in acqua. Credito:ITbM, Università di Nagoya
Chimici presso ITbM, L'Università di Nagoya ha sviluppato un colorante fluorescente super fotostabile chiamato PhoxBright 430 (PB430) per visualizzare l'ultrastruttura cellulare mediante microscopia a super risoluzione. L'eccezionale fotostabilità di questo nuovo colorante consente l'imaging STED continuo. Con la sua capacità di etichettare le proteine con etichette fluorescenti, PB430 dimostra il suo utilizzo nella costruzione 3D e nell'imaging multicolore di strutture biologiche.
Microscopia a fluorescenza a super risoluzione, che ha ricevuto il Premio Nobel 2014 per la Chimica, consente ai ricercatori di visualizzare i sistemi biologici e acquisire una comprensione dettagliata delle complesse dinamiche delle biomolecole. In particolare, La microscopia a riduzione delle emissioni stimolate (STED) è ampiamente utilizzata per esaminare i processi nei sistemi viventi grazie alla sua velocità di acquisizione rapida e alla compatibilità con molti campioni biologici.
I chimici dell'Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM) dell'Università di Nagoya hanno sviluppato un nuovo colorante fluorescente fotostabile, PhoxBright 430 (PB430), che consente l'imaging STED continuo a super-risoluzione di cellule marcate con fluorescenza. Poiché PB430 contiene una frazione funzionale per consentire la coniugazione con un anticorpo, specifici bersagli biomolecolari all'interno di una cellula possono essere colorati mediante immunofluorescenza. L'eccezionale fotostabilità di PB430 ha permesso ai ricercatori di costruire un'immagine STED 3-D dei microtubuli cellulari e di ottenere immagini STED multicolore di citoscheletri immunomarcati fluorescenti combinando PB430 fotostabili e coloranti disponibili in commercio.
Le proprietà uniche di PB430 lo rendono un potente strumento per rivelare le strutture e le funzioni delle cellule, e potrebbe essere applicato alla visualizzazione prolungata del movimento di organelli e molecole all'interno delle cellule. I risultati di questo studio sono stati recentemente riportati nel Giornale della Società Chimica Americana .
Per ottenere un'alta risoluzione nella microscopia STED, un campione biologico etichettato con un fluoroforo (un colorante fluorescente utilizzato per etichettare campioni biologici come proteine, tessuti e cellule) viene irradiato con un raggio di eccitazione a fluorescenza insieme a un raggio STED a forma di ciambella per sopprimere l'eccitazione delle molecole circostanti. Sebbene sia una tecnica potente, la necessità di un raggio STED ad alta intensità, che provoca il fotosbiancamento dei coloranti, ha inibito l'uso pratico della microscopia STED nell'imaging continuo di cellule vive.
I ricercatori hanno precedentemente segnalato un colorante fluorescente, C-Naphox, che mostra una forte fotostabilità nell'imaging STED. Il gruppo ha ora ottimizzato la struttura di C-Naphox e sviluppato il nuovo colorante fluorescente fotostabile, che può essere utilizzato per la visualizzazione di strutture all'interno delle cellule.
PB430 mostra un'eccezionale fotostabilità rispetto ai coloranti convenzionali, come mostrato nel numero di immagini confocali che possono essere prese senza perdere la relativa intensità di fluorescenza. Il nuovo colorante può anche etichettare proteine, come gli anticorpi ed è in grado di scansionare la cellula lungo l'asse z con un passo di 50 nm, con conseguente ricostruzione dell'immagine 3D-STED del citoscheletro con risoluzione dell'asse z di 160 nm. Credito:ITbM, Università di Nagoya
"C-Naphox ha dimostrato di essere un colorante estremamente fotostabile per l'imaging STED di vari materiali, quindi abbiamo deciso di ottimizzare ulteriormente le sue proprietà e applicarlo per visualizzare ultra-strutture, "dice Masayasu Taki, un professore associato presso ITbM e uno dei leader di questa ricerca. "Il nostro nuovo colorante, PB430 mostra una maggiore solubilità in acqua, fluorescente efficientemente in mezzi acquosi, ed è in grado di marcare gli anticorpi. Siamo stati lieti di osservare che mostra anche un'elevata fotostabilità in condizioni STED, "dice Taki.
Chenguang Wang, un ricercatore post-dottorato nel gruppo di ricerca del professor Shigehiro Yamaguchi presso ITbM, sintetizzato PB430 ed effettuato gli esperimenti di imaging STED. In modo simile a C-Naphox, il nuovo colorante fluorescente è stabile all'aria ed è costituito da una struttura rinforzata, fuso ad anello, scheletro π-coniugato che contiene un'unità di fosforo P-ossido, che è l'origine del nome PhoxBright. Invece della frazione trifenilammina, PB430 ha un gruppo acido carbossilico che può coniugarsi con anticorpi per l'immunomarcatura tramite la formazione di un estere N-idrossilsuccinimidil (NHS).
Esperimenti di imaging STED di anticorpi coniugati con PB430 in cellule HeLa fissate hanno portato a immagini di fluorescenza di microtubuli immunomarcati, con solo leggero photobleaching. PB430 ha agito come un'etichetta fluorescente per le proteine e la sua intensità di fluorescenza è stata mantenuta anche quando è stata coniugata.
"L'elevata fotostabilità di PB430 consente l'imaging a fluorescenza che non era facilmente possibile con i coloranti convenzionali, " spiega Taki. "Ad esempio, PB430 può essere utilizzato nell'imaging 3-D-STED del citoscheletro, perché può resistere al raggio STED continuo nell'asse z dopo l'imaging nell'asse xy."
Per di più, il gruppo ha mostrato che PB430 potrebbe essere applicato all'imaging STED multicolore sfruttando la differenza di fotostabilità tra i vari coloranti fluorescenti. Hanno eseguito esperimenti di imaging STED di microtubuli e vimentina (proteine dei filamenti intermedi) del citoscheletro, immunomarcato con PB430 e Alexa Fluor 430 (un colorante fluorescente), rispettivamente. Poiché Alexa Fluor 430 sbianca la foto dopo aver scattato la prima immagine STED, la seconda immagine mostra solo i microtubuli marcati con PB430. Sottraendo la prima immagine dalla seconda immagine si rivelano i filamenti di vimentina etichettati con Alexa Fluor 430.
"Generalmente, l'imaging STED multicolore richiede diversi laser di eccitazione e un singolo raggio laser STED, ma nella combinazione di Alexa Fluor 430 con PB430, abbiamo solo bisogno di una singola coppia di laser di eccitazione e STED, " spiega Taki. "Utilizzando PB430, crediamo che sarà possibile condurre l'imaging STED multicolore con una serie di diverse combinazioni di vari coloranti fluorescenti. Il passo successivo è migliorare la permeabilità della membrana cellulare del colorante per visualizzare le funzioni di molte altre strutture cellulari, " lui continua.
"La nostra ricerca ha dimostrato che la forte fotostabilità e compatibilità fisiologica di PB430 consente l'imaging ripetuto, nonché l'imaging 3D e l'imaging multicolore delle cellule mediante microscopia STED, " afferma Yamaguchi. "Speriamo di poter applicare il nostro colorante fluorescente per l'imaging prolungato di cellule vive mediante microscopia STED e microscopia a singola molecola, al fine di esaminare vari processi biologici."
