Le membrane cellulari sono costituite da fosfolipidi e proteine attaccate o incorporate. Le proteine della membrana svolgono ruoli vitali nel metabolismo e nella vita della cellula. Non è possibile utilizzare la normale microscopia per visualizzare o caratterizzare proteine di adesione, proteine di trasporto e canali di proteine nella membrana cellulare. Utilizzando la microscopia elettronica e una tecnica chiamata "frattura del congelamento", che separa le membrane cellulari congelate, consente la visualizzazione della struttura della membrana e l'organizzazione delle proteine nel mare dei fosfolipidi. La combinazione di altri metodi con la fratturazione a freddo non solo ci aiuta a comprendere la struttura di diverse membrane cellulari e proteine di membrana, ma consente la visualizzazione e l'analisi dettagliata della funzione di specifiche proteine, batteri e virus. br>
Usando azoto liquido, campioni di tessuti biologici o cellule vengono rapidamente congelati per immobilizzare i costituenti delle cellule. Le membrane cellulari sono composte da due strati di fosfolipidi, chiamati un doppio strato, in cui le code lipidiche idrofobiche o che odiano l'acqua puntano verso l'interno della membrana e le estremità idrofile, o amanti dell'acqua, della molecola lipidica puntano verso l'esterno e verso l'interno della cella. Il campione congelato è incrinato o fratturato con un microtomo, che è uno strumento simile a un coltello per tagliare fette di tessuto sottile. Questo fa sì che la membrana cellulare si spacchi precisamente tra i due strati perché l'attrazione tra le code lipidiche idrofobiche rappresenta il punto più debole. Dopo la fratturazione, il campione subisce una procedura sottovuoto, chiamata "incisione a freddo". La superficie del campione fratturato è ombreggiata con carbonio e vapore di platino per creare una replica stabile, che segue i contorni del piano di frattura. L'acido è usato per digerire il materiale organico che aderisce alla replica, lasciando un sottile guscio di platino della superficie della membrana fratturata. Questo guscio viene quindi analizzato mediante microscopia elettronica.
Freeze Etching
L'incisione a freddo è l'essiccazione sotto vuoto di un campione biologico non fissato, congelato e congelato. La procedura di essiccazione sottovuoto è simile alla frutta e agli ortaggi liofilizzati che vengono confezionati e venduti nei negozi di alimentari. Senza incisione a freddo molti dettagli della struttura cellulare sono oscurati dai cristalli di ghiaccio. La fase di congelamento o di congelamento migliora ed estende il metodo originale di frattura del congelamento, consentendo l'osservazione delle membrane cellulari durante le varie attività. Permette l'analisi non solo della struttura della membrana, ma anche delle componenti intracellulari e fornisce informazioni strutturali dettagliate su batteri, virus e complessi proteici cellulari di grandi dimensioni.
Crea la parentesi (quasi) perfetta: ecco Come si crea la parentesi (quasi) perfetta: ecco come la microscopia elettronica
La microscopia elettronica può rivelare e ingrandire più di un milione di volte gli organismi o le strutture più piccoli, come batteri, virus, componenti intracellulari e persino proteine. La visualizzazione viene creata bombardando un campione ultrasottile con un raggio di elettroni. I due metodi di microscopia elettronica sono la microscopia elettronica a scansione, o SEM, e la microscopia elettronica a trasmissione, o TEM. I campioni di frattura da congelare vengono analizzati di routine con TEM. TEM ha una risoluzione migliore del SEM e offre informazioni strutturali fino a 3 nanometri di repliche.
Rivelare la struttura della membrana cellulare
Lo sviluppo e l'uso della microscopia elettronica a frattura congelata hanno dimostrato che le membrane plasmatiche delle cellule sono costituite da doppi strati lipidici e ha chiarito in che modo le proteine sono organizzate all'interno delle membrane cellulari. La frattura da congelamento conferisce un aspetto unico all'interno delle membrane cellulari, perché divide e separa i fosfolipidi di membrana in due fogli o facce opposte e complementari. Negli oltre 50 anni dall'introduzione della prima macchina per frattura congelata, realizzare una replica in platino è ancora l'unico modo per ottenere informazioni strutturali sulla membrana cellulare. La tecnica mostra se le proteine specifiche galleggiano o sono ancorate nella membrana cellulare e se e come alcune proteine si aggregano. Un metodo più recente - utilizzando anticorpi specifici per proteine specifiche - è combinato con la frattura del congelamento per identificare le proteine e la loro funzione nella membrana cellulare.
