La colorazione Gram è una procedura di colorazione differenziale che mostra quali batteri sono Gram-positivi o Gram-negativi in base al colore della loro macchia. L'alcol dell'acetone è un reagente utilizzato in questo processo per fornire la differenziazione del colore. I batteri Gram-positivi hanno uno spesso strato peptidoglicano e si colorano di viola, mentre i microrganismi Gram-negativi hanno uno strato peptidoglicano poco o niente e si colorano di rosa

Stain-Crystal Violet primario

preparato, il viola cristallo viene utilizzato per colorare prima il campione. A questo punto i batteri Gram-positivi e Gram-negativi appariranno viola. Di solito il cristallo viola viene applicato sulla diapositiva per 30 secondi prima di lavare via l'eventuale macchia in eccesso con acqua. Il violetto cristallino può aderire un po 'agli strati peptidoglicani, quindi non tutta la macchia primaria verrà lavata via con l'acqua.
Mordente-iodio

Lo iodio viene quindi aggiunto al campione per un minuto. Agisce come un mordente, che serve a fissare i coloranti in un processo di colorazione. Lo iodio svolge questa funzione legandosi al violetto cristallino e creando un complesso insolubile che aderisce molto meglio allo spesso strato peptidoglicano presente nelle cellule batteriche Gram-positive rispetto al solo violetto cristallino. Non c'è una fase di lavaggio con acqua dopo l'aggiunta di iodio.
Decolorizer-Alcohol

L'acetone o l'alcool etilico possono essere usati come agente decolorante. L'alcool dissolve i lipidi presenti nella membrana cellulare esterna dei batteri Gram-negativi, permettendo al complesso di cristallo viola-iodio di fuoriuscire dallo strato peptidoglicano più sottile. L'alcool viene aggiunto per 10 a 20 secondi; viene versato sul vetrino fino a quando tutto lo iodio viene lavato via e il deflusso è incolore. A questo punto del processo di colorazione di Gram, i batteri Gram-negativi sono incolori mentre i batteri Gram-positivi mantengono ancora il violetto cristallino. Una volta terminato, il vetrino deve essere sciacquato con acqua per fermare l'effetto decolorante.
Counterstain-Safranin

La safranina viene quindi aggiunta per aumentare la visibilità e il contrasto con i batteri Gram negativi incolori. La macchia rende questi batteri rosa al microscopio. Poiché la macchia viene aggiunta all'intero campione, colora anche i batteri Gram-positivi, ma il più scuro del violetto cristallino nasconde il colore rosa safranina più chiaro. Dopo che il campione di vetrini è stato inondato di safranina per circa un minuto, l'acqua viene utilizzata per lavare via ogni macchia in eccesso che non aderisce alle cellule batteriche.