Quando si lavora con la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), una buona calibrazione è assolutamente essenziale per garantire risultati affidabili e di qualità. La corretta calibrazione di uno strumento HPLC inizia con la creazione di uno standard di calibrazione adeguato. Nella maggior parte dei casi, la calibrazione richiede infatti una serie di standard di concentrazione crescente per produrre quella che è nota come curva di calibrazione. Questa è una linea tracciata e un'equazione associata che descrive la relazione tra la concentrazione della sostanza chimica sottoposta a test e la risposta del rivelatore HPLC.
Determina la sostanza chimica che desideri testare usando l'HPLC (il " analita "). Ad esempio, si potrebbe desiderare di testare una serie di bevande analcoliche per il contenuto di fruttosio, nel qual caso il fruttosio sarebbe l'analita.
Ottenere una quantità di sostanza chimica analita di purezza adeguata. Normalmente la purezza dovrebbe essere superiore al 99% e l'analita dovrebbe essere acquistato da una società di fornitura di sostanze chimiche affidabili. Nel caso del fruttosio, ad esempio, si acquisterebbe fruttosio puro da un venditore di sostanze chimiche e non da un negozio di alimentari.
Determina le concentrazioni massime e minime previste dell'analita nei campioni che si intende testare sul HPLC. Nel caso delle bibite analcoliche, esaminereste le etichette delle bevande e determinerete il contenuto di fruttosio più basso e più alto tra le bevande che testerete. Tenere presente che il campione iniziale (la bevanda analcolica) può essere diluito o diversamente manipolato durante la preparazione per l'analisi (a seconda del metodo HPLC utilizzato) e quindi la concentrazione dell'analita nei campioni effettivamente iniettati sull'HPLC può essere modificata. È la concentrazione dell'analita nei campioni come eseguita sull'HPLC da prendere in considerazione.
Determina il solvente in cui dissolverai il tuo analita per creare gli standard di calibrazione. Questo solvente deve essere in grado di sciogliere correttamente l'analita su un intervallo di concentrazione relativamente ampio (almeno tanto quanto nei campioni che si intende testare). Inoltre, questo solvente dovrebbe idealmente essere abbastanza simile alla "fase mobile:" il solvente utilizzato per trasportare i campioni attraverso lo strumento HPLC.
Calcolare la quantità di analita richiesta per realizzare una soluzione "standard standard" del analita. Ciò si ottiene moltiplicando la concentrazione richiesta per lo stock standard per il volume desiderato. La concentrazione dell'analita in questa soluzione deve essere almeno del 10% superiore alla concentrazione di campione più alta prevista. Se la concentrazione di fruttosio più alta prevista in un campione di bibita analcolica è di 8 grammi /100 millilitri, allora lo stock standard potrebbe essere ridotto a una concentrazione di 10 grammi di fruttosio /100 millilitri. Un volume ragionevole è di 500 millilitri, quindi 8/100 mL x 500 mL = 40 grammi di fruttosio.
Pesare la quantità necessaria di analita con un adeguato livello di precisione. Spesso è adatto un valore in grammi preciso a una o due cifre decimali, ma per alcuni metodi può essere necessaria una maggiore precisione.
Trasferire l'analita pesata in un matraccio volumetrico del volume necessario e aggiungere il solvente desiderato il segno di riempimento sul pallone. L'uso di una beuta volumetrica (piuttosto che un becher graduato, ad esempio) aumenta la precisione del valore di concentrazione standard dello stock. Assicurarsi che tutto l'analita sia trasferito nel pallone; utilizzare un po 'del solvente per lavarlo, se necessario.
Fermare il matraccio volumetrico e agitare delicatamente o capovolgerlo fino a quando l'analita non si è completamente sciolto.
Effettuare una serie di diluizioni variabili dello stock standard trasferendo volumi noti dello standard azionario in matracci volumetrici, utilizzando pipette per trasferimento accurato, quindi aggiungendo solvente. La concentrazione standard più bassa dovrebbe essere inferiore al campione più basso da analizzare. Nell'esempio della bevanda analcolica, se la concentrazione di fruttosio più bassa prevista in un campione è di 2 grammi /100 ml, è possibile utilizzare uno standard da 1 grammo /100 ml. Ciò avverrebbe mediante una diluizione di dieci volte dello standard azionario. Le serie standard dovrebbero includere un totale di 5 o 6 concentrazioni, quindi sarebbero necessarie diluizioni aggiuntive per produrre standard di 3, 5 e 8 grammi di fruttosio /ml. Ora avete una serie di soluzioni standard con cui calibrare l'HPLC.
Suggerimento
È possibile creare standard di calibrazione contenenti più di un analita, se necessario. È spesso buona norma filtrare i campioni di calibrazione (e gli standard) prima di iniettarli sull'HPLC per rimuovere eventuali particelle fini che potrebbero ostruire lo strumento.
Avviso
Alcuni standard si degradano rapidamente dopo essere stati fatto. Assicurati che i tuoi standard vengano sostituiti di frequente, se questo è il caso. Come con tutte le procedure chimiche, osservare le precauzioni adeguate quando si lavora con analiti o solventi potenzialmente dannosi come quelli che sono tossici o infiammabili.
