I canali ionici nelle vescicole di membrana che mediano il trasporto intracellulare delle proteine ​​svolgono un ruolo cruciale nella fisiologia cellulare. Un metodo sviluppato da un team della Ludwig-Maximilians-Universitaet (LMU) a Monaco di Baviera ora consente di studiarli con maggiore specificità che mai.

Piccole vescicole legate alla membrana, noti come endosomi e lisosomi, servono come veicoli per il trasporto di carichi proteici all'interno delle cellule animali. Nelle membrane delle vescicole sono incorporate proteine ​​chiamate canali ionici, che controllano il passaggio di particelle atomiche caricate elettricamente ("ioni") dentro e fuori questi organelli intracellulari. I difetti di queste proteine ​​giocano un ruolo centrale nella patogenesi di molte malattie, e la dissezione delle loro funzioni molecolari è vitale per lo sviluppo di terapie efficaci per questi disturbi. PD Christian Grimm e il Professor Christian Wahl-Schott del Dipartimento di Farmacia (Direttore:Professor Martin Biel) alla LMU di Monaco sono tra i maggiori specialisti europei nell'uso della cosiddetta tecnica patch-clamp per lo studio dei canali ionici nelle membrane cellulari . Nell'ultimo numero della rivista Protocolli Natura , descrivono come hanno adattato il metodo per l'uso con le vescicole endolisosomiali. In un secondo studio, pubblicato sulla rivista Cell Chemical Biology, proseguono dimostrando come il patch clamping può essere applicato a specifiche classi funzionali di vescicole di trasporto. Questa svolta apre prospettive completamente nuove per la caratterizzazione dei canali ionici e dei meccanismi che li regolano.

Il sistema endolisosomiale è costituito da tre classi distinte di endosomi:precoce, endosomi tardivi e di riciclaggio - così come i lisosomi. Questi vari tipi di vescicole hanno funzioni diverse. Le vescicole endosomiali precoci si formano per ripiegamento di chiazze della membrana cellulare in risposta all'attivazione di, ad es. proteine ​​recettoriali da molecole di segnalazione extracellulare. Ciò consente ai recettori di essere rimossi dalla superficie e distaccati dai loro ligandi attivatori. I recettori vengono quindi trasmessi agli endosomi di riciclaggio e restituiti alla membrana cellulare, o consegnato a endosomi tardivi che li convogliano ai lisosomi, dove sono degradati enzimaticamente. Questo sistema di traffico partecipa a numerosi processi metabolici e svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del metabolismo dei metalli pesanti e nella corretta localizzazione di specifici recettori di membrana. I canali ionici che si trovano nelle membrane vescicolari sono intimamente coinvolti in tutte queste operazioni. "Secondo gli studi sulle loro popolazioni proteiche, lisosomi ed endosomi contengono fino a 70 distinte proteine ​​di trasporto dei canali ionici, " dice Grimm.

Il metodo patch-clamp consente di misurare il passaggio di particelle cariche attraverso singoli canali ionici in patch di membrana, e quindi per determinare se il canale è attivo o inattivo. Fare così, si disegna una piccola porzione di membrana in una micropipetta applicando una debole aspirazione, assicurando così che si formi una tenuta ermetica tra la membrana e la parete della pipetta. Con l'aiuto di un microelettrodo, si può quindi applicare una tensione di prova e far passare la corrente attraverso qualsiasi canale ionico presente nella patch. "Il problema è che, nel loro stato normale, le vescicole sono troppo piccole per essere accessibili tramite una pipetta patch, quindi devono essere ingranditi prima di poter effettuare qualsiasi misurazione, " dice Grimm. Tuttavia, gli strumenti farmacologici finora utilizzati a tale scopo agiscono indiscriminatamente su tutti i tipi di vescicole endolisosomiali. Nel tentativo di scoprire agenti più specifici, i ricercatori della LMU hanno esaminato una libreria di composti e identificato una particolare combinazione di due tossine biologiche che induce selettivamente l'allargamento degli endosomi precoci facendoli fondere l'uno con l'altro. Inoltre, sono stati in grado di dimostrare che una terza molecola ingrandisce selettivamente endosomi e lisosomi tardivi. In particolare, nessuna di queste sostanze agisce sul riciclaggio degli endosomi.

"Questo rappresenta un progresso significativo, perché ora abbiamo due serie di strumenti che ci consentono di utilizzare approcci più specifici e chiedere quali canali sono attivi in ​​quali tipi di vescicole, " spiega Grimm. Infatti, lui e i suoi colleghi hanno utilizzato i nuovi agenti per dimostrare che il cosiddetto canale ionico TRPML3, che controlla il passaggio dei cationi carichi positivamente e il pH (livello di acidità) all'interno delle vescicole, è attivo sia negli endosomi precoci che tardivi e nei lisosomi. In contrasto, il relativo canale TRPML1 si trova negli endosomi tardivi e nei lisosomi, ma non nei primi endosomi. Le mutazioni nei canali TRPML contribuiscono alla patogenesi di gravi condizioni congenite come mucolipidosi, una rara classe di malattie metaboliche che compromettono la funzione del sistema nervoso. "Grazie alla nostra estensione del patch clamping alle vescicole intracellulari, ora possiamo indirizzare questi canali ionici con maggiore selettività. Questo è importante anche nella ricerca di sostanze in grado di inibire in modo specifico le funzioni di particolari canali ionici a fini terapeutici, " precisa Grimm.