Vari metodi di stima della posizione centrale basati su immagini (denominati "adattamento del centroide") come i metodi di adattamento gaussiano 2-D sono stati comunemente usati nella microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM) per determinare con precisione la posizione di ciascun fluoroforo. Eppure è ancora una sfida migliorare la precisione della localizzazione laterale della singola molecola su scala molecolare ( <2 nm) per l'imaging di nanostrutture ad alto rendimento.

In uno studio pubblicato online in Metodi della natura , Il Prof. Xu Tao e il Prof. Ji Wei dell'Istituto di Biofisica dell'Accademia Cinese delle Scienze hanno sviluppato un nuovo processo di microscopia interferometrica di localizzazione di singole molecole con illuminazione strutturata a modulazione rapida, chiamata esposizione selettiva ottica ripetitiva (ROSE).

ROSE utilizza sei diverse frange di interferenza di fase e direzione per eccitare le molecole fluorescenti. L'intensità delle molecole fluorescenti è strettamente correlata alla fase delle frange di interferenza. Una molecola di fluorescenza è localizzata dalle intensità di più modelli di eccitazione di una frangia di interferenza, fornendo un miglioramento di circa due volte nella precisione della localizzazione. Questa tecnica ha spinto la risoluzione della microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM) a meno di 3 nm (precisione di localizzazione di ~ 1 nm).

I ricercatori hanno prima progettato tre diverse griglie reticolari di strutture di origami di DNA con 5-, Spaziatura punto-punto di 10 e 20 nm per verificare le prestazioni di ROSE. Sia l'adattamento del centroide convenzionale che ROSE potrebbero risolvere la struttura a 20 nm con lo stesso budget di fotoni. ROSE potrebbe anche risolvere chiaramente la distanza di 10 nm, che non può essere risolto mediante il montaggio del baricentro.

I ricercatori hanno dimostrato che ROSE potrebbe risolvere una struttura a 5 nm con una risoluzione di ~ 3 nm su un ampio campo visivo di 25 x 25 μm ² , il che significa che ROSE ha la capacità di spingere il potere risolutivo di SMLM su scala molecolare.

Inoltre, utilizzando ROSE per analizzare le nanostrutture cellulari, i ricercatori hanno dimostrato che ROSE presenta vantaggi nella risoluzione della struttura cava dei singoli filamenti di microtubuli, piccole fossette rivestite di clatrina (CCP) e nanostrutture cellulari del filamento di actina. L'analisi della correlazione dell'anello di Fourier (FRC) ha indicato che ROSE ha migliorato la risoluzione finale di due volte rispetto al metodo di adattamento del centroide.

ROSE può essere esteso all'imaging su scala nanometrica 3D introducendo ulteriori modelli di eccitazione lungo la direzione assiale. I ricercatori prevedono che questo metodo potrebbe estendere l'applicazione di SMLM nell'analisi dinamica delle biomacromolecole e negli studi strutturali su scala molecolare.