Una nuova tecnica sviluppata dai ricercatori dell'ARC Center of Excellence for Nanoscale BioPhotonics (CNBP) aiuterà a far luce su questioni biologiche migliorando la qualità e la quantità di informazioni che possono essere estratte con la microscopia a fluorescenza.

La tecnica, La "microscopia multicanale assistita da sbiancamento" (BAMM) prende un'attuale debolezza di vecchia data della microscopia a fluorescenza - il fotosbiancamento - e la trasforma in un punto di forza che migliora l'output di imaging fino a tre volte, senza hardware aggiuntivo richiesto.

Segnalato sul giornale Ottica biomedica Express , BAMM aiuterà i ricercatori a ottenere informazioni biologiche sugli intricati processi che avvengono all'interno delle cellule viventi. Ciò include l'interazione tra proteine ​​e molecole che hanno il potenziale per avere un impatto su un'ampia gamma di aree sanitarie dalla fertilità, al dolore, alle malattie cardiache e altro ancora.

"La microscopia a fluorescenza è una delle tecniche più utilizzate in biologia. È qui che le molecole che emettono luce chiamate fluorofori sono legate a bersagli cellulari estremamente piccoli come proteine, materiale genetico o altre biomolecole di interesse, "dice il dottor Antony Orth, CNBP Research Fellow presso RMIT University e autore principale del documento di ricerca.

"Quando il fluoroforo è eccitato dalla luce del microscopio, reagisce emettendo una specifica firma cromatica. Vedere quella firma di colore al microscopio ci aiuta a vedere, tracciare e comprendere il bersaglio cellulare a cui è stato legato il fluoroforo".

In particolare dice il dottor Orth, puoi attaccare diversi fluorofori colorati a diversi bersagli cellulari, tutto in un unico campione, per massimizzare i dati e le informazioni sulle immagini ricevute.

Questo approccio tradizionale alla microscopia a fluorescenza è versatile, ma c'è una grande limitazione:lo spettro visibile (o colore), dove operano la maggior parte dei fluorofori, può essere affollato. In un esperimento ideale, ogni target dovrebbe essere scelto per avere un'emissione di colore distinta, ma questo diventa sempre più difficile da organizzare con l'aumentare del numero di obiettivi.

"Lo spettro del colore visibile si estende su un intervallo da 400 nanometri (nm) a 700 nm e solo circa 200 nm di questo intervallo sono disponibili per l'emissione di colori a fluorescenza, " spiega il dottor Orth.

"Un tipico fluoroforo emette su una gamma di 50 nm dello spettro dei colori. Dividere 200 nm dello spettro visibile in segmenti da 50 nm significa che i colori degli emettitori fluorescenti iniziano a fondersi insieme quando si tenta di spremere in più di quattro colori".

"Questo in genere limita i ricercatori a quattro o meno bersagli fluorescenti in un campione, "dice il dottor Orth.

"Tipicamente, la maggior parte degli esperimenti sono ancora meno ambiziosi, incorporando solo due o tre obiettivi. Il cuore del problema è che solo una proprietà del fluoroforo, il suo colore, viene utilizzata per l'identificazione".

Per aiutare a superare questo limite, Il dott. Orth ei suoi co-ricercatori hanno sviluppato una tecnica innovativa chiamata "microscopia multicanale assistita da sbiancamento" (BAMM) per aumentare la produzione di immagini.

"Invece di usare il colore per differenziare i fluorofori, usiamo la quarta dimensione del tempo e sfruttiamo un fenomeno chiamato photobleaching:l'oscuramento di una raccolta di fluorofori o pigmenti sotto ripetuta esposizione alla luce, "dice il dottor Orth.

"Poiché ogni tipo di fotosbianca al fluoroforo a una velocità diversa, possiamo distinguere tra fluorofori senza utilizzare alcuna informazione sul colore. Usiamo il tasso di photobleaching come identificatore."

"Se abbinato alle tradizionali informazioni sui colori, questa dimensione aggiuntiva del foto-sbiancamento consente agli scienziati di utilizzare 2-3 volte più tipi di molecole fluorescenti, tutto in un campione. Questo ci consente di estrarre molte più informazioni da una singola indagine".

"I ricercatori saranno in grado di progettare test più informativi, ad esempio evidenziando cinque obiettivi quando in precedenza solo due erano pratici. Non dovranno più evitare di utilizzare due fluorofori dello stesso colore, poiché una sola differenza di fotostabilità è sufficiente per distinguere tra i due obiettivi, " lui dice.

Tradizionalmente, il fenomeno del photobleaching (o sbiadimento) è stato dannoso per il processo di microscopia a fluorescenza. È qui che l'illuminazione continua e ad alta intensità dal microscopio distrugge permanentemente la capacità di un fluoroforo di emettere fluorescenza in modo che l'imaging del bersaglio cellulare diventi impossibile.

"BAMM trasforma il fotosbiancamento da una debolezza di vecchia data della microscopia a fluorescenza in una forza significativa per consentire una maggiore identificazione dei bersagli cellulari, "dice il dottor Orth.

"BAMM non richiede hardware aggiuntivo, è relativamente semplice da fare e non richiede alcuna preparazione specializzata del campione. È un nuovo approccio estremamente entusiasmante che ha il potenziale per avvantaggiare tutti gli utenti di microscopia a fluorescenza e la loro scienza esplorativa, " lui dice.

I ricercatori formalmente coinvolti nel progetto BAMM erano affiliati con CNBP (Università RMIT e Università di Adelaide) e Thermo Fisher Scientific.