Mentre le placche amiloidi sono state a lungo strettamente associate ai meccanismi che guidano la malattia di Alzheimer, visualizzare come si assemblano le proteine ​​amiloidi continua a rivelarsi difficile. Le fibrille amiloidi di dimensioni nanometriche sono solo una frazione delle dimensioni che i migliori microscopi ottici sono in grado di risolvere. Un nuovo lavoro che ripropone uno dei più antichi reagenti conosciuti per l'aspetto dell'amiloide per aiutare a fornire un'immagine più chiara di come le fibrille si uniscono.

Un team di ricercatori della Washington University di St. Louis, STATI UNITI D'AMERICA., e University College London nel Regno Unito, ha dimostrato un nuovo approccio per l'imaging su nanoscala delle strutture amiloidi senza alterarle chimicamente. Usando la tioflavina T (ThT), un colorante noto da quasi un secolo per diventare fluorescente a contatto con fibrille amiloidi, il nuovo metodo consente ai ricercatori di visualizzare le proteine ​​associate alle placche amiloidi, chiamato La42 e La40, più preciso che mai.

Kevin Spehar, un co-autore principale del team, descriveranno il loro lavoro in una presentazione orale, intitolato "Imaging a super risoluzione a lungo termine di strutture amiloidi mediante il legame transitorio della tioflavina T, " all'OSA Biophotonics Congress:Optics in the Life Sciences meeting a Tucson, Arizona, STATI UNITI D'AMERICA., 14-17 aprile 2019.

Oltre a produrre immagini di aggregati amiloidi con risoluzione su scala nanometrica, la tecnica del gruppo consente ai ricercatori di scattare istantanee di come le fibrille si accumulano e reagiscono al loro ambiente. Testare il loro approccio, il team è stato in grado di vedere direttamente per la prima volta un farmaco anti-amiloide all'opera.

"Quando si tratta di amiloide, usiamo parole come 'monomero' e 'oligomero' e 'fibrilla, ' ma quelle parole descrivono davvero solo ciò che siamo stati in grado di vedere prima, ", ha detto il co-autore dell'articolo, il dott. Matthew Lew. "Queste parole sono completamente inadeguate per descrivere con precisione il complesso, vari assemblaggi di queste molecole."

Mentre attaccare i metodi di assemblaggio dell'amiloide si distingue come una delle principali terapie proposte per il morbo di Alzheimer, Dott. Jan Bieschke, un altro coautore dell'articolo, ha affermato che lo studio degli aggregati amiloidi presenta sfide uniche per i ricercatori.

Tecniche di immunofluorescenza, che sono impiegati in molte altre aree della biologia e utilizzano anticorpi per etichettare le biomolecole, falliscono perché interromperebbero la tendenza dell'amiloide ad aggregarsi, rendendo impossibile studiare con precisione il meccanismo che guida l'Alzheimer.

La microscopia crioelettronica offre una risoluzione superiore ma può fornire solo un singolo, istantanea statica di un campione di amiloide.

"Imaging della dinamica dell'amiloide per tempi prolungati è cruciale se vogliamo capire il modo in cui un farmaco influenza l'aggregazione dell'amiloide o come disassembla una fibra amiloide, " ha detto Bieschke.

Per affrontare questi problemi, il team si è rivolto al fluoroforo di lunga data, questo, che evita di modificare l'amiloide non legandosi covalentemente ad essa in primo luogo. Anziché, ogni molecola di ThT emette fluorescenza per circa 15 millisecondi mentre è a contatto con l'amiloide.

Il risultato, Lew ha detto, è che il ruolo di ThT nell'imaging si sposta da un semplice fluoroforo a un sensore molecolare per l'amiloide.

"Questo sta letteralmente usando una molecola da uno a due nanometri come sensore, " ha detto. "Penso che questo concetto abbia un grande potenziale per essere generalizzato per applicazioni di imaging biomedico e chimico".

L'imaging ha permesso al team di osservare come le fibrille Aβ42 si sono rimodellate e si sono dissolte con l'introduzione dell'epi-gallocatechina gallato, un farmaco antiaggregante modello scoperto da Bieschke e colleghi.

"La maggior parte delle tecniche di microscopia a fluorescenza, soprattutto quando si punta alla risoluzione nanometrica, richiedono un'attenta messa a punto dei reagenti e delle condizioni, " Bieschke ha detto. "Il nostro approccio ha rimosso gran parte di quella complessità. Allo stesso tempo, può essere combinato con i tradizionali approcci basati su anticorpi per l'imaging multiplex".

Bieschke spera di migliorare la tecnica per essere in grado di vedere il modo in cui le strutture amiloidi si diffondono nell'Alzheimer e nelle malattie correlate. Lew ha detto che vede molti usi futuri per l'utilizzo di molecole come ThT come sensori molecolari, che vanno dalla ricerca sul morbo di Parkinson al diabete alla scienza dei materiali.