Un microscopio ultra preciso che supera i limiti della microscopia a super risoluzione vincitrice del premio Nobel consentirà agli scienziati di misurare direttamente le distanze tra le singole molecole.

I ricercatori medici dell'UNSW hanno raggiunto capacità di risoluzione senza precedenti nella microscopia a singola molecola per rilevare le interazioni tra le singole molecole all'interno delle cellule intatte.

Il Premio Nobel per la Chimica 2014 è stato assegnato per lo sviluppo della tecnologia di microscopia a fluorescenza a super risoluzione che ha offerto ai microscopisti la prima visione molecolare all'interno delle cellule, una capacità che ha fornito nuove prospettive molecolari su sistemi e processi biologici complessi.

Ora il limite di rilevamento dei microscopi a molecola singola è stato nuovamente infranto, e i dettagli sono pubblicati nell'attuale numero di Progressi scientifici .

Mentre le singole molecole potrebbero essere già osservate e tracciate con la microscopia a super-risoluzione, le interazioni tra queste molecole avvengono su una scala almeno quattro volte inferiore a quella risolta dai microscopi a singola molecola esistenti.

"Il motivo per cui la precisione di localizzazione dei microscopi a molecola singola è normalmente di circa 20-30 nanometri è perché il microscopio si muove effettivamente mentre rileviamo quel segnale. Questo porta a un'incertezza. Con gli strumenti a super risoluzione esistenti, non possiamo dire se una proteina è legata o meno a un'altra proteina perché la distanza tra loro è più breve dell'incertezza delle loro posizioni, "dice la professoressa scientifica Katharina Gaus, leader del gruppo di ricerca e capo del nodo EMBL Australia di UNSW Medicine in Single Molecule Science.

Per aggirare questo problema, il team ha costruito circuiti di feedback autonomi all'interno di un microscopio a singola molecola che rileva e riallinea il percorso ottico e lo stadio.

"Non importa cosa fai a questo microscopio, fondamentalmente trova la via del ritorno con una precisione inferiore al nanometro. È un microscopio intelligente. Fa tutte le cose che un operatore o un tecnico dell'assistenza deve fare, e lo fa 12 volte al secondo, "dice il professor Gaus.

Misurare la distanza tra le proteine

Con il design e i metodi delineati nel documento, il sistema di feedback progettato dal team UNSW è compatibile con i microscopi esistenti e offre la massima flessibilità per la preparazione del campione.

"È una soluzione davvero semplice ed elegante per un grosso problema di imaging. Abbiamo appena costruito un microscopio all'interno di un microscopio, e tutto ciò che fa è allineare il microscopio principale. Che la soluzione che abbiamo trovato sia semplice e pratica è un vero punto di forza in quanto consentirebbe una facile clonazione del sistema, e rapida adozione della nuova tecnologia, "dice il professor Gaus.

Per dimostrare l'utilità del loro microscopio a singola molecola a feedback ultra preciso, i ricercatori lo hanno usato per eseguire misurazioni dirette della distanza tra le proteine ​​di segnalazione nelle cellule T. Un'ipotesi popolare nell'immunologia cellulare è che queste cellule immunitarie rimangano in uno stato di riposo quando il recettore delle cellule T si trova accanto a un'altra molecola che funge da freno.

Il loro microscopio ad alta precisione è stato in grado di mostrare che queste due molecole di segnalazione sono in effetti ulteriormente separate l'una dall'altra nelle cellule T attivate, rilasciando il freno e attivando la segnalazione del recettore delle cellule T.

"Le tecniche di microscopia convenzionali non sarebbero in grado di misurare con precisione un cambiamento così piccolo in quanto la distanza tra queste molecole di segnalazione nelle cellule T a riposo e nelle cellule T attivate differiva solo di 4-7 nanometri, "dice il professor Gaus.

"Questo mostra anche quanto siano sensibili questi macchinari di segnalazione alla segregazione spaziale. Al fine di identificare processi normativi come questi, dobbiamo eseguire misurazioni precise della distanza, e questo è ciò che questo microscopio consente. Questi risultati illustrano il potenziale di questa tecnologia per scoperte che non potrebbero essere fatte con nessun altro mezzo".

Ricercatore post-dottorato, Dott. Simao Pereira Coelho, insieme al dottorato studente Jongho Baek, che da allora ha ottenuto il suo dottorato di ricerca. laurea-ha guidato il design, sviluppo, e costruzione di questo sistema. Il Dr. Baek ha anche ricevuto il Dean's Award per il miglior dottorato di ricerca. Tesi per questo lavoro.