Un gruppo di ricerca guidato dal professor MATOBA Osamu (Organizzazione per la ricerca avanzata e integrata) dell'Università di Kobe ha creato con successo la fluorescenza 3-D e l'imaging di fase delle cellule viventi basato sull'olografia digitale. Hanno usato cellule vegetali con marcatori proteici fluorescenti nei loro nuclei per dimostrare questo sistema di imaging.

Il gruppo era composto dal Project Assistant Professor Manoj KUMAR e dal Assistant Professor Xiangyu QUAN (entrambi della Graduate School of System Informatics), Professore AWATSUJI Yasuhiro (Kyoto Institute of Technology) e Professore Associato TAMADA Yosuke (Utsunomiya University).

Questa tecnologia costituirà una base per l'imaging delle cellule viventi, indispensabile nel campo delle scienze della vita. Si prevede inoltre che l'utilizzo di questa tecnologia per visualizzare i processi delle cellule staminali nelle piante aumenterà la nostra comprensione di essi.

Questi risultati della ricerca sono apparsi sulla rivista Rapporti scientifici , pubblicato da Springer Nature il 15 maggio.

Background di ricerca

Il microscopio ottico fu inventato alla fine del XVI secolo e lo scienziato britannico Robert Hooke fu il primo a scoprire le cellule a metà del XVII secolo. L'invenzione è stata sviluppata in nuove tecnologie come il microscopio a contrasto di fase (1953 Premio Nobel per la Fisica), che permette di osservare le cellule viventi senza bisogno di colorarle, e imaging cellulare fluorescente, in cui molecole specifiche vengono marcate utilizzando proteine ​​fluorescenti (Premio Nobel per la Chimica 2008) e osservate nelle cellule viventi. Questi sono diventati strumenti essenziali per l'osservazione nelle scienze della vita e in campo medico.

L'imaging di fase utilizza la differenza nella lunghezza ottica della luce mentre passa attraverso un campione biologico per rivelare informazioni strutturali su di esso. L'imaging a fluorescenza fornisce informazioni su molecole specifiche all'interno del campione biologico, e possono rivelare le loro funzioni. Però, la struttura intracellulare e la motilità sono complesse. La capacità di visualizzare informazioni fisiche multidimensionali comprendenti l'imaging di fase e fluorescenza sarebbe utile per comprendere questi aspetti. Un sistema di imaging in grado di generare diverse informazioni fisiche simultaneamente e istantaneamente da cellule viventi in 3D servirebbe da tecnologia di base per portare innovazione in biologia.

Il sistema di imaging multimodale ibrido costruito in questo studio può ottenere informazioni 3-D fluorescenti e di fase in un unico scatto. Consente ai ricercatori di visualizzare quantitativamente e simultaneamente le informazioni strutturali o funzionali di un campione biologico utilizzando un'unica piattaforma.

Metodologia di ricerca

In questo studio, i ricercatori hanno costruito un microscopio olografico digitale multimodale in grado di registrare simultaneamente le informazioni sulla fluorescenza di un campione e le informazioni sulla fase (Figura 1). Questo utilizza l'olografia digitale come base, per cui vengono registrate le informazioni sulla luce interferita dall'oggetto e quindi vengono utilizzati calcoli ottici effettuati dal computer per generare informazioni spaziali 3D sull'oggetto.

Il microscopio in studio è composto da due diversi sistemi ottici. in primo luogo, il sistema di imaging a fluorescenza 3D olografico, come mostrato sul lato destro della Figura 1. Per ottenere le informazioni sulla fluorescenza 3-D, un modulatore di luce spaziale viene utilizzato per dividere la luce fluorescente emessa dalle molecole fluorescenti in due onde luminose che possono interferire l'una con l'altra.

A questo punto, l'informazione 3-D dalla luce dell'oggetto viene preservata dando a una delle onde luminose un raggio di curvatura e una direzione di propagazione leggermente diversi; allo stesso tempo, le due onde luminose si trovano su un percorso ottico condiviso (procedendo per lo più lungo lo stesso asse) consentendo di effettuare una misurazione dell'interferenza temporalmente stabile. Questo sistema ottico è stato formulato in questo studio, chiarire per la prima volta la distribuzione dell'intensità di interferenza registrata. Questa formula ha permesso ai ricercatori di trovare condizioni sperimentali che avrebbero migliorato la qualità delle immagini fluorescenti ricostruite. Sono stati in grado di generare immagini tridimensionali di cellule viventi e delle loro strutture applicando questo sistema olografico 3-D fluorescente. Le molecole e le strutture delle cellule viventi sono state marcate con proteine ​​fluorescenti, consentendo di osservare i loro comportamenti dinamici attraverso questa nuova microscopia a fluorescenza 3-D.

La tecnologia di imaging sviluppata da questo studio consente immagini 3D, che fino ad ora hanno impiegato relativamente più tempo per essere generati tramite scansione laser, da generare in un unico scatto senza bisogno di scansione.

Prossimo, come mostrato a sinistra della Figura 1, è il sistema di imaging di fase 3D olografico. Una cellula vegetale vivente è costituita da componenti come un nucleo, mitocondri, cloroplasti, e una sottile parete cellulare. È possibile visualizzare le strutture di questi componenti dalle differenze di fase (lunghezza del cammino ottico). In questo sistema, l'adozione dell'interferometro Mach-Zehnder consente di utilizzare l'onda piana di riferimento, consentendo di ottenere facilmente la frangia di interferenza ottimale per ogni oggetto misurato.

Questo microscopio olografico digitale è stato creato unificando i sistemi di misurazione della fluorescenza e della fase.

Successivamente, questo microscopio è stato utilizzato per visualizzare le cellule vegetali viventi. È stato condotto un esperimento per dimostrare che è possibile condurre osservazioni 4-D applicando la 3-D spaziale e un asse temporale (unidimensionale). Sono state utilizzate le patene di Physcomitrella di muschio e le sfere fluorescenti con una dimensione media di 10 μm. Le figure 2 e 3 mostrano i risultati dell'esperimento per la fluorescenza 3-D simultanea e l'imaging di fase del muschio. La Figura 2 (b) mostra che sette nuclei sono visibili quando viene utilizzato un microscopio a fluorescenza convenzionale a campo intero. Di questi sette, i nuclei numerati 1, 2, e 4 sono a fuoco, però, questo non è il caso per i nuclei in posizioni a diverse profondità in quanto è un'immagine fluorescente debole con sfocatura diffusa. Nella metodologia proposta da questo studio per risolvere questo problema, le informazioni sulle onde luminose fluorescenti sono state estratte dall'ologramma fluorescente nella Figura 2 (c). Sulla base di queste informazioni, l'algoritmo numerico di propagazione di Fresnel può ottenere immagini fluorescenti ricostruite a qualsiasi profondità o distanza. Perciò, le immagini a fuoco di più nuclei fluorescenti a diverse profondità sono state ripristinate da una singola immagine senza scansione.

Figura 2 (d), (e), e (f) mostrare le immagini ricostruite su tre piani diversi. La distanza assiale tra (d) ed (e) è di 10 micrometri, e 15 micrometri tra (e) e (f). Le frecce gialle indicano i nuclei che sono a fuoco. È possibile vedere quale dei sette nuclei nell'immagine di fluorescenza è a fuoco sui tre piani.

La figura 3 mostra la distribuzione quantitativa della fase per i tre piani a diverse profondità. È stato possibile visualizzare i singoli cloroplasti (ce ne sono molti intorno ai bordi delle cellule, come indicato dai picchi rossi in Figura 3 (b)). Lo spessore della cella, come calcolato dai valori di fase quantitativi misurati, era di circa 17 micrometri, una dimensione molto vicina ad altri valori di riferimento.

Nella figura 4, puoi vedere perline fluorescenti (di circa 10 micrometri di dimensione) che galleggiano in una soluzione. Le informazioni di fase e fluorescenza sono state generate dalle registrazioni utilizzando la metodologia proposta. Le perle si muovono anche nella direzione della profondità, quindi è possibile recuperare la loro posizione 3D modificando la distanza di ricostruzione per mantenerli a fuoco.

In questo studio, è stato sviluppato un microscopio olografico digitale multimodale, capace di misure simultanee di fase 3-D e fluorescenza. Con la capacità di condurre contemporaneamente l'imaging di fase quantitativa e di fluorescenza, si ritiene che questo metodo servirà come nuova tecnologia di base per la visualizzazione di cellule e tessuti biologici viventi. In particolare, è stato dimostrato che questo microscopio può essere applicato a cellule vegetali complesse. Potrebbe essere utilizzato per acquisire una comprensione diversificata del processo di formazione delle cellule staminali nelle piante, che si riproducono più facilmente delle cellule animali. Nel futuro, potrebbe essere possibile utilizzare queste informazioni per controllare il processo delle cellule staminali tramite la stimolazione della luce. La riproduzione e la crescita efficienti delle piante ottenute attraverso l'imaging proposto e la stimolazione futura potrebbero essere applicate allo sviluppo di un sistema di coltivazione alimentare.

Questa tecnologia potrebbe essere sviluppata migliorando ulteriormente l'efficienza di utilizzo della luce. Nell'olografia digitale, è necessario allargare spazialmente il diametro del fascio, dividerlo in due, e poi sovrapporli nuovamente per sfruttare l'interferenza tra i due percorsi di luce. Perciò, è inoltre necessario aumentare l'energia fluorescente affinché venga osservata dal sensore di immagine. Per raggiungere questo obiettivo, sarebbe necessaria una grande quantità di energia luminosa per illuminare le cellule viventi, però, il danno cellulare causato dalla luce sarebbe un grosso problema. Si pensa che un ologramma di volume possa essere utilizzato per aumentare l'efficienza di utilizzo della luce evitando la fototossicità cellulare.

Un altro problema è che la distribuzione 3D ricostruita si estende nella direzione di propagazione della luce (la direzione della profondità dell'oggetto), risoluzione assiale decrescente. I ricercatori stanno lavorando su metodi che utilizzano l'apprendimento profondo e il filtraggio per sopprimere questa estensione nella direzione della profondità e migliorare la qualità dell'immagine.