Panoramica del sistema Miniscope3D. Rispetto ai precedenti modelli Miniscope e MiniLFM, il nostro Miniscope3D è più leggero e più compatto. Rimuoviamo la lente del tubo del miniscopio e posizioniamo una maschera di fase ottimizzata spessa 55 μm all'arresto dell'apertura (piano di Fourier) della lente dell'obiettivo GRIN. Un insieme sparso (64 per profondità) di funzioni di diffusione del punto di calibrazione (PSF) viene acquisito mediante la scansione di una perla fluorescente verde di 2,5 μm in tutto il volume. Utilizziamo questo set di dati per pre-calcolare un efficiente modello in avanti che acquisisca con precisione le aberrazioni variabili sul campo. Il modello in avanti viene quindi utilizzato per risolvere in modo iterativo un problema inverso per ricostruire volumi 3D da misurazioni 2D a colpo singolo. La ricostruzione 3D qui è di un tardigrado etichettato in modo fluorescente che nuota liberamente. Credito:Luce:scienza e applicazioni, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
Un microscopio a fluorescenza in miniatura che pesa meno offrendo un'alta risoluzione rispetto ai dispositivi esistenti avrà una gamma di applicazioni nella biologia dei sistemi. I microscopi a fluorescenza in miniatura esistenti sono una tecnica standard nelle scienze della vita, ma offrono solo informazioni bidimensionali (2D). In un nuovo rapporto ora su Luce naturale:scienza e applicazioni , Kyrollos Yanny, Nick Antipa e un team di scienziati del Joint Graduate Program in Bioingegneria, Ingegneria Elettrica e Informatica presso l'Università della California, Berkeley e l'Universite libre de Bruxelles Belgio, sviluppato un microscopio a fluorescenza 3-D a scatto singolo. Hanno progettato il nuovo dispositivo noto come Miniscope3D sostituendo la lente tubolare di un miniscopio 2-D convenzionale con una maschera di fase multifocale ottimizzata all'arresto dell'apertura dell'obiettivo. Utilizzando il dispositivo, Yanny e Antipa et al. attività neurale registrata otticamente in animali in movimento libero e in applicazioni di imaging in situ a lungo termine in incubatori e all'interno di dispositivi lab-on-a-chip.
Imaging a fluorescenza in miniatura e innovazioni tecniche
I microscopi a fluorescenza in miniatura sono importanti nella biologia dei sistemi per le registrazioni ottiche dell'attività neurale negli animali in movimento libero, imaging in situ a lungo termine in incubatori e dispositivi medici. Tali microscopi sono noti anche come "miniscopi" e sono costituiti da parti stampate in 3D, sebbene offra solo l'imaging a fluorescenza 2-D. I metodi a scatto singolo possono consentire velocità di acquisizione più elevate e una risoluzione temporale limitata dalla frequenza dei fotogrammi della fotocamera. Per esempio, un microscopio a campo luminoso in miniatura (MiniLFM) precedentemente sviluppato può elaborare l'attività neurale con un algoritmo ottimizzato. In questo lavoro, Yanny et al. ha sviluppato un miniscopio 3D per ottenere una risoluzione più elevata con un peso inferiore rispetto alle tecniche esistenti. Il team ha testato le capacità microscopiche mediante l'imaging di obiettivi con risoluzione fluorescente, nonché campioni biologici e tessuto cerebrale di topo che nuotano liberamente. Hanno convalidato i risultati ricostruiti rispetto alla microscopia a due fotoni per comprendere i limiti della nuova tecnica.
Fabbricazione di maschere di fase con nanoscribe. (a) Le cuciture rettangolari portano a cuciture (linee nere) che attraversano le numerose microlenti, mentre le cuciture adattive mettono le cuciture ai confini delle microlenti per mitigare gli artefatti. (b) Confronto tra PSF progettate e sperimentali a poche profondità di campione, mostrando un buon accordo, con lieve degrado ai margini del volume. Credito:Luce:scienza e applicazioni, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
Per ottenere immagini di alta qualità in un piccolo, dispositivo a basso peso, Yanny et al. posizionato la maschera di fase (dove la luce che passa attraverso la maschera subirà uno sfasamento proporzionale allo spessore del materiale) nello spazio di Fourier per ridurre il carico computazionale e migliorare la compattezza. Hanno aggiunto funzionalità 3D al miniscopio 2D al costo di una piccola perdita di risoluzione laterale e di un rapporto segnale/rumore inferiore. L'algoritmo ha unito la teoria ottica con il rilevamento compresso per fabbricare le maschere di fase ottimizzate. La tecnica ha facilitato una nuova architettura del microscopio 3D in miniatura con una risoluzione più elevata, progetti open source, fabbricazione di qualità superiore e un efficiente schema di calibrazione o algoritmo di ricostruzione.
Caratterizzazione del microscopio computazionale e studio del cervello di topo
Il team ha testato le prestazioni del microscopio computazionale utilizzando campioni di complessità crescente per acquisire registrazioni dinamiche 3D. Hanno misurato la risoluzione laterale a diverse profondità mediante l'acquisizione di immagini di un bersaglio a risoluzione fluorescente. Hanno quindi convalidato l'accuratezza dei loro risultati utilizzando la microscopia a due fotoni. Per esempio, il Miniscope3D potrebbe recuperare accuratamente tutte le immagini ricostruite della post-elaborazione del campione di sfere fluorescenti 3-D. Hanno mostrato il potenziale del metodo utilizzando campioni neurobiologici in cui le regioni contrassegnate da proteine fluorescenti verdi esprimevano popolazioni sparse di neuroni in tutto il campione. Le immagini ricostruite ottenute da diverse parti dell'ippocampo mostravano dendriti che attraversavano la superficie insieme ai singoli corpi cellulari. Quando Yanny et al. successivi campioni dinamici studiati di nuoto libero, tardigradi tinti di verde (noti anche come orsi d'acqua), le immagini ricostruite hanno mostrato l'efficienza dell'imaging Miniscope3D per tracciare organismi biologici in movimento ad alta risoluzione nello spazio-tempo.
Caratterizzazione sperimentale. (a) Ricostruzioni di un bersaglio USAF fluorescente in diverse posizioni assiali per determinare la risoluzione laterale dipendente dalla profondità. Recuperiamo una risoluzione di 2,76 μm sulla maggior parte dell'intervallo di profondità di 390 μm, con il caso peggiore di 3,9 μm (linee arancioni tratteggiate contrassegnano le posizioni dell'inserto, e le caselle gialle nei riquadri indicano i gruppi risolti più piccoli). Si noti che l'obiettivo della risoluzione ha livelli discreti di risoluzione che provocano salti nei dati e che la risoluzione qui si riferisce allo spazio tra le barre, non la larghezza della coppia di linee. (b) Ricostruzione di un campione spesso 160 μm di perline fluorescenti da 4,8 μm rispetto a un'immagine di scansione 3D a due fotoni (sono mostrate le proiezioni di intensità massima nei piani yx e zx). Il nostro sistema rileva le stesse caratteristiche, con una dimensione del punto laterale leggermente più grande. Credito:Luce:scienza e applicazioni, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
Ricostruzione di neuroni etichettati con GFP in una fetta di cervello di topo otticamente pulita di 300 µm di spessore che dimostra la risoluzione di un singolo neurone e dendriti chiaramente risolti che attraversano il volume assialmente. Credito:Luce:scienza e applicazioni, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
Ricostruzione 3D di tardigradi che nuotano liberamente. (Sinistra) Dati grezzi. (A destra) Ricostruzione di tardigradi colorati SYBR-verde che si muovono liberamente. Credito:Credito:Luce:Scienza e applicazioni, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
Applicazioni e accessibilità del dispositivo
La maggior parte delle applicazioni di Miniscope3D sarà simile alla microscopia 3-D e MiniLFM (microscopia a campo luminoso in miniatura), che è considerato il gold standard per l'imaging a fluorescenza 3-D in miniatura a scatto singolo. Rispetto a MiniLFM, però, il nuovo metodo Miniscope3D ha offerto molteplici miglioramenti tra cui obiettivi multifocali, migliore risoluzione laterale e un aumento di 10 volte del volume di misurazione utilizzabile. Le prestazioni migliorate sono arrivate in un pacchetto hardware più piccolo del MiniLFM con un peso più leggero per osservare liberamente gli organismi in movimento. Il metodo ha inoltre consentito la ricostruzione sperimentale con o senza dispersione del tessuto cerebrale di topo a risoluzione di un singolo neurone. Il team ottimizzerà i limiti esistenti del dispositivo, inclusa la dispersione, per ulteriori applicazioni.
Basandosi su una popolare piattaforma di miniscopio open source, Yanny et al. ha fornito l'accessibilità per la progettazione di Miniscope3D. In questo modo, Kyrollos Yanny, Nick Antipa e colleghi hanno fornito un prototipo 3-D come un'opportunità per aggiornare i miniscopi 2-D attualmente in uso in 450 laboratori. I risultati sperimentali erano in buon accordo con la progettazione e l'analisi teoriche per fungere da utile quadro per sistemi 3-D personalizzati a scatto singolo.
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