La microscopia a fluorescenza è ampiamente utilizzata in biochimica e scienze della vita perché consente agli scienziati di osservare direttamente le cellule e alcuni composti all'interno e intorno ad esse. Le molecole fluorescenti assorbono la luce all'interno di un intervallo di lunghezze d'onda specifico e quindi la riemettono all'intervallo di lunghezze d'onda più lungo. Però, il principale limite delle tecniche convenzionali di microscopia a fluorescenza è che i risultati sono molto difficili da valutare quantitativamente; l'intensità della fluorescenza è significativamente influenzata sia dalle condizioni sperimentali che dalla concentrazione della sostanza fluorescente. Ora, un nuovo studio condotto da scienziati giapponesi è destinato a rivoluzionare il campo della microscopia a fluorescenza a vita.

Un modo per aggirare il problema convenzionale è concentrarsi sulla durata della fluorescenza anziché sull'intensità. Quando una sostanza fluorescente viene irradiata con un breve lampo di luce, la fluorescenza risultante non scompare immediatamente ma in realtà "decadde" nel tempo in modo specifico per quella sostanza. La tecnica di microscopia a vita in fluorescenza sfrutta questo fenomeno, che è indipendente dalle condizioni sperimentali, quantificare le molecole fluorescenti e i cambiamenti nel loro ambiente. Però, il decadimento della fluorescenza è estremamente veloce, e le normali fotocamere non possono catturarlo. Mentre è possibile utilizzare invece un fotorilevatore a punto singolo, deve essere scansionato in tutta l'area del campione per poter ricostruire un'immagine 2D completa da ciascun punto misurato. Questo processo prevede la movimentazione di pezzi meccanici, che limita notevolmente la velocità di acquisizione dell'immagine.

In questo recente studio, pubblicato in Progressi scientifici , il team di scienziati ha sviluppato un nuovo approccio per acquisire immagini di fluorescenza a vita senza la necessità di una scansione meccanica. Professor Takeshi Yasui, dall'Istituto di Fotonica Post-LED (pLED), Università di Tokushima, Giappone, che ha condotto lo studio, dice, "Il nostro metodo può essere interpretato come una mappatura simultanea di 44, 400 "cronometri" basati sulla luce su uno spazio 2D per misurare la durata della fluorescenza, il tutto in un unico scatto e senza scansione."

Uno dei pilastri principali del loro metodo è l'uso di un pettine a frequenza ottica come luce di eccitazione per il campione. Un pettine di frequenza ottica è essenzialmente un segnale luminoso composto dalla somma di molte frequenze ottiche discrete con una spaziatura costante tra di loro. La parola "pettine" in questo contesto si riferisce a come appare il segnale quando viene tracciato rispetto alla frequenza ottica:un denso ammasso di picchi equidistanti che si alzano dall'asse della frequenza ottica e assomigliano a un pettine per capelli. Utilizzando attrezzature ottiche speciali, una coppia di segnali a pettine di frequenza di eccitazione viene scomposta in singoli segnali di battito ottici (battiti ottici a doppio pettine) con diverse frequenze di modulazione dell'intensità, ciascuno recante una singola frequenza di modulazione e irradiato sul campione bersaglio. La chiave qui è che ogni raggio di luce colpisce il campione in una posizione spazialmente distinta, creando una corrispondenza biunivoca tra ogni punto sulla superficie 2-D del campione (pixel) e ciascuna frequenza di modulazione dei battiti ottici dual-comb.

A causa delle sue proprietà di fluorescenza, il campione riemette parte della radiazione catturata preservando la corrispondenza frequenza-posizione. La fluorescenza emessa dal campione viene quindi semplicemente focalizzata utilizzando una lente su un fotorilevatore a punto singolo ad alta velocità. Finalmente, il segnale misurato viene trasformato matematicamente nel dominio della frequenza, e la durata della fluorescenza a ciascun "pixel" è facilmente calcolata dal relativo ritardo di fase che esiste tra il segnale di eccitazione a quella frequenza di modulazione rispetto a quello misurato.

Grazie alla sua velocità superiore e all'elevata risoluzione spaziale, il metodo di microscopia sviluppato in questo studio semplificherà lo sfruttamento dei vantaggi delle misurazioni della durata della fluorescenza. "Poiché la nostra tecnica non richiede la scansione, in ogni scatto è garantita una misurazione simultanea su tutto il campione, "dice il prof. Yasui, "Questo sarà utile nelle scienze della vita in cui sono necessarie osservazioni dinamiche di cellule viventi". Oltre a fornire una visione più approfondita dei processi biologici, questo nuovo approccio potrebbe essere utilizzato per l'imaging simultaneo di più campioni per il test dell'antigene, che è già utilizzato per la diagnosi di COVID-19.

Forse la cosa più importante, questo studio mostra come i pettini di frequenza ottica, che venivano usati solo come "regolatori di frequenza, " può trovare un posto nelle tecniche di microscopia per spingere la busta nelle scienze della vita. È promettente per lo sviluppo di nuove opzioni terapeutiche per trattare malattie intrattabili e migliorare l'aspettativa di vita, a vantaggio dell'intera umanità.