un, Diagramma energetico di STED-SREF. B, Configurazione spettroscopica di STED-SREF. Qui viene utilizzata la modalità nitrile di Rodamina 800 (Rh800). C, Imaging SREF/STED-SREF di cellule di E. coli colorate con Rh800 con lunghezze d'onda della pompa impostate a 836 nm (risonanza off della modalità nitrile) e 838 nm (risonanza vibrazionale della modalità nitrile). L'accoppiamento diretto dell'esaurimento delle emissioni stimolate (STED) con l'imaging SREF non riesce a ottenere i miglioramenti di risoluzione desiderati. Lo sfondo di fluorescenza anti-Stokes (mostrato nella pompa SREF=836 nm) ha un ruolo indesiderato nell'impedire l'adozione diretta della tecnica di fluorescenza a super risoluzione. Credito:Hanqing Xiong†, Naixin Qian†, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei min.
L'imaging a super-risoluzione reale oltre il limite di diffrazione rimane una sfida importante per la microscopia Raman a campo lontano, specialmente nelle applicazioni biologiche. Sfruttando la fluorescenza eccitata Raman stimolata (SREF) come contrasto vibrazionale ultrasensibile, un team della Columbia University ha recentemente inventato una nuova microscopia vibrazionale a super risoluzione. Il loro nuovo metodo apre la super-risoluzione, Imaging vibrazionale multicolore a risoluzione spettrale nanometrica di sistemi biologici.
È stata una lunga ricerca per sviluppare tecniche di imaging a super risoluzione per la microscopia Raman, che presenta vantaggi intrinseci di specificità chimica rispetto alla sua controparte a fluorescenza. Nonostante l'importanza percepita e gli ampi sforzi di ricerca, la vera super-risoluzione (definita come diffrazione illimitata) l'imaging Raman di sistemi biologici nel campo lontano ottico rimane impegnativo a causa della carenza di sensibilità per la diffusione Raman convenzionale. Di conseguenza, quei metodi di imaging vibrazionale a super risoluzione riportati si basano sulla saturazione dell'eccitazione, esaurendo, o non linearità di ordine superiore delle transizioni Raman. Questi richiedono una potenza laser estremamente intensa per ottenere un moderato miglioramento della risoluzione (spesso inferiore a un fattore 2), che inibisce la sua utilità per l'applicazione biologica.
In un nuovo articolo pubblicato su Luce:scienza e applicazioni , un team di scienziati, guidato dal professor Wei Min della Columbia University, STATI UNITI D'AMERICA, ha sviluppato una nuova microscopia vibrazionale a super risoluzione che sfrutta la fluorescenza eccitata Raman stimolata (SREF) come contrasto vibrazionale ultrasensibile. SREF accoppia l'eccitazione vibrazionale con il rilevamento della fluorescenza e consente la spettroscopia Raman a tutto campo con sensibilità fino alla singola molecola. Però, l'accoppiamento diretto dell'esaurimento delle emissioni stimolate (STED) con l'imaging SREF non riesce a ottenere l'imaging a super risoluzione a causa della presenza dello sfondo di fluorescenza anti-stokes, che non può essere esaurito dal raggio STED.
un, lo spettro SREF grezzo della modalità nitrile Rh800 acquisito mediante eccitazione SREF convenzionale (curva rossa) e il corrispondente spettro FM-SREF privo di sfondo acquisito mediante eccitazione FM-SREF. B, l'imaging FM-SREF e la pre-risonanza elettronica hanno stimolato l'imaging di scattering Raman (epr-SRS) delle cellule di E. coli colorate con Rh800. C, la corrispondente distribuzione di intensità per FM-SREF e epr-SRS lungo le corrispondenti linee tratteggiate bianche in (b). D, strutture chimiche dei due coloranti SREF impiegati. e, gli spettri di assorbimento (curve solide) e di emissione (curve tratteggiate) dei due coloranti in acqua, che non sono risolvibili per la spettroscopia di fluorescenza convenzionale. F, gli spettri FM-SREF dei modi nitrilici dei due coloranti. G, imaging FM-SREF multicolore delle cellule di S. cerevisiae. Credito:Hanqing Xiong†, Naixin Qian†, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei min.
In questo nuovo lavoro, il team ha ideato una strategia di modulazione di frequenza (FM) per rimuovere questo sfondo a banda larga. Modulando temporalmente la frequenza di eccitazione attivando e disattivando la risonanza vibrazionale mirata, ma sempre all'interno dell'ampia larghezza di riga dello sfondo, possono generare una modulazione di intensità sul segnale vibrazionale puro (ma non sullo sfondo). Il segnale vibrazionale privo di sfondo può essere successivamente demodulato da un rilevamento di lock-in. Confrontando con il tipico spettro SREF grezzo, lo spettro acquisito da FM-SREF rappresenta il segnale SREF puro, che consente l'imaging SREF senza sfondo ad alto contrasto. Hanno ulteriormente sintetizzato nuovi coloranti SREF modificati con isotopi per facilitare l'imaging biologico FM-SREF multicolore con un forte contrasto vibrazionale. Due colori vibrazionali sono separati da FM-SREF con diafonia minima, che è quasi impossibile con la microscopia a fluorescenza convenzionale. Tale specificità chimica dell'imaging vibrazionale presenta vantaggi unici per l'imaging ottico multiplexato.
un, lo schema del sistema della microscopia STED-FM-SREF. B, imaging delle stesse cellule di E. coli colorate con Rh800 mediante microscopia FM-SREF e microscopia STED-FM-SREF e le corrispondenti distribuzioni di intensità lungo le linee tratteggiate. C, imaging dello stesso nucleo di cellule Cos7 colorato con composto A mediante microscopia FM-SREF e microscopia STED-FM-SREF e le corrispondenti distribuzioni di intensità lungo le linee tratteggiate. Credito:Hanqing Xiong†, Naixin Qian†, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei min.
Finalmente, integrando STED con FM-SREF senza sfondo, hanno realizzato immagini vibrazionali a super risoluzione ad alto contrasto con STED-FM-SREF, la cui risoluzione spaziale è determinata solo dal rapporto segnale-rumore. Hanno dimostrato un miglioramento della risoluzione più di due volte nei sistemi biologici con una potenza di eccitazione laser moderata. Con la futura ottimizzazione della strumentazione e delle sonde di imaging, La microscopia STED-FM-SREF è prevista per aiutare un'ampia varietà di applicazioni biologiche, con la sua superba risoluzione, alta sensibilità, contrasto vibrazionale unico, e potere di eccitazione biocompatibile.
