Un gruppo di ricerca guidato da Takashi Saito, della Ehime University Graduate School of Medicine, ha sviluppato un microscopio a fluorescenza a foglio di luce ad eccitazione a 2 fotoni che (1) riduce la fototossicità, (2) estende il campo visivo, e (3) aumenta la risoluzione spaziale. Questo microscopio, quando viene utilizzato per l'osservazione del pesce medaka, ha permesso di osservare l'intero corpo dell'embrione (un campo visivo esteso) a una risoluzione a livello cellulare (alta risoluzione spaziale) senza influenzare la crescita del pesce (bassa fototossicità) nell'arco di tre giorni di sviluppo embrionale. Questo risultato è stato pubblicato sulla rivista scientifica Comunicazioni sulla natura .

Il microscopio a fluorescenza è ampiamente utilizzato nel campo delle scienze della vita per osservare le molecole all'interno di una cellula in modo non invasivo. La microscopia a fluorescenza a foglio luminoso consente di registrare immagini tridimensionali con elevata velocità di acquisizione e alta risoluzione spaziale. Però, nei microscopi a foglio di luce convenzionali, è difficile limitare il fotodanneggiamento ai tessuti viventi, e anche difficile ottenere contemporaneamente un ampio FOV e una risoluzione spaziale elevata (a livello di cella).

Sviluppo di un ampio campo di eccitazione a due fotoni, microscopio a foglio leggero

Il gruppo di ricerca della Ehime University di Takashi Saitou, Sota Takanezawa, e Takeshi Imamura hanno utilizzato il fenomeno dell'eccitazione a due fotoni come chiave per risolvere questo problema. Il microscopio a eccitazione a due fotoni con laser a infrarossi consente l'imaging delicato (a bassa fototossicità) di organismi viventi. Però, perché la luce deve essere focalizzata su un intervallo ristretto per indurre l'eccitazione a due fotoni, il campo di eccitazione (nel microscopio a foglio leggero, il campo visivo) è stretto. Per risolvere questo, i ricercatori hanno sviluppato un'unità ottica di illuminazione semplice con un raggio di Bessel che espande il raggio di propagazione del laser nella direzione dell'asse ottico (Fig. 1A). Questa unità può allungare la lunghezza del raggio a 600-1000 μm mantenendo una risoluzione assiale di 2-3 μm quando si utilizza un obiettivo NA0.3 con ingrandimento 10x. Utilizzando questa unità ottica, hanno costruito una microscopia a foglio di luce con eccitazione a due fotoni (Fig. 1B), che consente di eseguire l'imaging di tutto il corpo delle larve di medaka con risoluzione cellulare (Fig. 1C).

Il medaka è ampiamente utilizzato come organismo modello per i vertebrati. È adatto per l'imaging fluorescente poiché è piccolo e trasparente. Per valutare l'applicabilità del microscopio per l'uso su organismi viventi, i ricercatori hanno eseguito una valutazione della fototossicità. Ciò ha rivelato una riduzione del fotodanneggiamento rispetto al microscopio a foglio di luce a fascio gaussiano convenzionale. Si suggerisce quindi di essere adatto per l'imaging dal vivo a lungo termine. I ricercatori hanno quindi applicato l'imaging time-lapse a lungo termine del medaka transgenico in cui l'endotelio linfatico è etichettato con una proteina fluorescente verde, ed è riuscito nell'imaging in tempo reale per tre giorni a intervalli di cinque minuti (Fig. 2).

In questo studio, i ricercatori hanno sviluppato un nuovo microscopio a fluorescenza a foglio di luce ad alte prestazioni. Utilizzando questa tecnologia, gli scienziati possono osservare quasi tutti i processi di crescita embrionale del pesce medaka con un'elevata risoluzione cellulare su tutto il corpo del pesce. Questa tecnologia dovrebbe contribuire alla comprensione a livello molecolare dello sviluppo embrionale, la delucidazione della patogenesi delle malattie legate allo stile di vita, e per promuovere la tecnologia dello sviluppo di farmaci.