La luce, e tutte le onde, possono piegarsi intorno agli angoli degli ostacoli che si trovano lungo il suo percorso. A causa di questo fenomeno, chiamata diffrazione, è impossibile focalizzare la luce su un punto più piccolo della metà della sua lunghezza d'onda. In altre parole, la risoluzione più alta che si può teoricamente ottenere utilizzando un microscopio ottico è di circa 250 nm, una barriera chiamata limite di diffrazione. Sfortunatamente, questa risoluzione non è sufficiente per osservare le strutture cellulari fini, come quelli che si trovano nei neuroni.

Da più di un secolo, i microscopisti sono stati ostacolati da questa classica barriera fino all'invenzione della microscopia a fluorescenza a super risoluzione. Un approccio particolarmente potente è stato sviluppato alla fine degli anni '90 e ha coniato la microscopia a "esaurimento delle emissioni stimolate" (STED). Questa tecnica richiede che il campione target contenga fluorofori, che sono composti che assorbono la luce ad una lunghezza d'onda e poi la riemettono ad una più lunga. Nella versione più semplice della microscopia STED, i fluorofori sono eccitati in uno spot circolare mediante irradiazione con un laser focalizzato a diffrazione limitata. Quindi, una porzione a forma di ciambella attorno allo spot viene irradiata con una luce meno energetica, il raggio di esaurimento, che spegne la fluorescenza mediante il processo di emissione stimolata. Così, l'effetto finale è che solo i fluorofori al centro della ciambella riemettono fotoni. Poiché quell'area può essere resa arbitrariamente piccola, questo consente la microscopia a super risoluzione.

Sebbene la microscopia STED sia stata una vera svolta per l'osservazione della morfologia dei neuroni vivi a una risoluzione più elevata, c'è ancora spazio per miglioramenti. In un recente studio pubblicato su Neurofotonica , un team di scienziati guidati dal Dr. U. Valentin Nägerl dell'Université de Bordeaux ha sviluppato un metodo di calibrazione semplice ma efficace che consente un imaging STED più preciso a profondità dei tessuti più elevate. Il loro approccio si basa sull'analisi e sulla correzione di una delle principali fonti di errore sistematico nella microscopia STED per campioni biologici:l'aberrazione sferica del fascio di esaurimento.

Quando si esegue l'imaging di un campione di tessuto a profondità superiori a 40 μm, il raggio di esaurimento subisce vari tipi di sfocatura e degradazione (aberrazione) e perde la sua forma accuratamente realizzata, che è essenziale per il metodo STED. L'aberrazione sferica è il più grande offensore ed è stato quello che i ricercatori hanno preso di mira. La loro strategia era quella di preparare prima un campione fantasma di tessuto cerebrale, un proxy a base di gel con un indice di rifrazione simile a quello del cervello reale. Questo campione fantasma conteneva fluorofori omogeneamente dispersi e nanoparticelle d'oro, che ha permesso al team di visualizzare e quantificare chiaramente come la forma del raggio di esaurimento è stata distorta mentre penetrava più in profondità. Quindi, hanno calcolato i necessari pre-aggiustamenti che dovrebbero essere fatti al raggio di svuotamento in base alla profondità del tessuto in modo che la sua forma finale si avvicini maggiormente a quella ideale. Le regolazioni sono state effettuate utilizzando ottiche adattive, che è una tecnologia originariamente sviluppata dagli astronomi per migliorare le immagini telescopiche che soffrono di aberrazioni causate dall'atmosfera terrestre.

Una volta calibrata la forma del fascio di esaurimento secondo i test fantasma, gli scienziati hanno proceduto all'immagine del tessuto neurale vivo. Hanno confrontato i risultati della normale microscopia STED, microscopia STED corretta, e la microscopia a due fotoni, una tecnica specificatamente adattata per l'imaging dei tessuti profondi. I risultati sono stati abbastanza convincenti:le immagini STED corrette hanno catturato i dettagli fini dei dendriti neurali più profondi molto meglio delle immagini STED standard. "Utilizzando la nostra strategia di calibrazione, potremmo misurare strutture neuronali fino a 80 nm a una profondità di 90 μm all'interno del tessuto biologico e ottenere un aumento del segnale del 60% dopo la correzione per l'aberrazione sferica, " dice Nagerl.

Ji Yi, professore di ingegneria biomedica alla Johns Hopkins University osserva che "la microscopia a super risoluzione è stata applicata principalmente a campioni sottili, come le celle a strato singolo, dove la dispersione della luce è trascurabile. Il team guidato da Valentin Nägerl ha implementato l'ottica adattiva in una microscopia a deplezione di emissione stimolata a due fotoni (2P-STED), e ha raggiunto una risoluzione di 80 nm delle spine dendritiche dei neuroni di imaging attraverso il tessuto cerebrale di 90 micron. Ciò è degno di nota perché la super-risoluzione è difficile da mantenere nei tessuti più spessi, in particolare data la qualità altamente dispersiva del tessuto cerebrale." Yi spiega che il progresso faciliterà lo studio delle attività e delle interazioni neurali.

Considerando che questo nuovo processo di calibrazione è robusto, semplice da implementare, e relativamente poco costoso, potrebbe essere facilmente incorporato nelle pratiche di laboratorio standard per ottenere risultati migliori con i microscopi STED, purché il campione fantasma preparato corrisponda alle proprietà ottiche del campione biologico. A questo proposito, Nägerl afferma, "il nostro approccio non si limita ai campioni di cervello; potrebbe essere adattato ad altri tessuti con indici di rifrazione noti e relativamente omogenei, così come altri tipi di preparati, anche potenzialmente intatto, cervello di topo vivo."