Quando gli scienziati avevano bisogno di visualizzare la struttura della proteina spike, che i coronavirus usano per infiltrarsi nelle cellule umane, si sono rivolti alla microscopia crioelettronica. Uno degli strumenti di imaging più potenti nell'arsenale di un ricercatore, la microscopia crioelettronica (crio-EM) può visualizzare proteine, patogeni e vari componenti delle cellule quasi fino ai loro singoli atomi.

Ma la preparazione dei campioni per il crio-EM è un processo ingombrante che si basa sull'etano, un potente refrigerante in forma liquida, e un gas infiammabile a temperatura ambiente soggetto a esplosioni.

Un nuovo studio pubblicato il 7 settembre su Giornale dell'Unione Internazionale di Cristallografia dimostra che i campioni crio-EM possono essere preparati con un refrigerante più sicuro e meno costoso, l'azoto liquido, e questi campioni possono produrre immagini ancora più nitide rispetto a quelli preparati con etano. I risultati capovolgono la saggezza convenzionale risalente agli anni '80, e può migliorare la sicurezza e la qualità della crio-EM.

"L'etano non è un prodotto chimico standard di laboratorio. È pericoloso, e usarlo aggiunge ulteriori complicazioni, " ha detto l'autore senior Robert Thorne, professore di fisica al College of Arts and Sciences e Weiss Presidential Fellow. "L'azoto liquido è il refrigerante preferito."

Cryo-EM funziona sparando elettroni attraverso molecole che vengono congelate istantaneamente in uno strato d'acqua vetroso, catturare più immagini sfocate delle molecole all'interno del ghiaccio. I software sofisticati possono spesso fare la media di quei clip sfocati in un'immagine 3D nitida, ma non in modo coerente.

Parte della sfocatura deriva dal campione stesso. Quando l'acqua che racchiude le molecole si raffredda troppo lentamente, forma cristalli di ghiaccio che degradano l'immagine. Gli scienziati aggirano questo problema utilizzando l'etano per raffreddare l'acqua così rapidamente che si trasforma in un bicchiere, foglio senza cristalli. Ma un congelamento così rapido mette sotto stress il lenzuolo, che poggia su una sottile pellicola d'oro. Quando il fascio di elettroni colpisce il foglio, lo stress fa muovere le molecole, sfocatura dell'immagine finale in un fenomeno noto come movimento indotto dal raggio.

"Abbiamo due fattori opposti, " disse Thorne. "Vogliamo raffreddare i campioni velocemente, per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio e per catturare la struttura biologica delle molecole. Ma vogliamo anche raffreddare i campioni il più lentamente possibile per ridurre al minimo il loro movimento durante l'imaging".

L'etano raffredda i campioni molto rapidamente. Ma i ricercatori devono usare l'azoto liquido per convertire il gas etano in un liquido, e poi più azoto liquido per conservare i campioni dopo che sono stati congelati. "L'etano è ingombrante, è pericoloso, e, in definitiva, i campioni finiscono comunque in azoto liquido, " disse Thorne.

L'azoto liquido si raffredda a velocità circa 50 volte più lente di quelle dell'etano, secondo i rapporti degli ultimi 40 anni, e questo non è abbastanza veloce per convertire l'acqua in un foglio di vetro. Ma nel 2006, Il gruppo di ricerca di Thorne ha scoperto che il principale fattore che rallenta l'azoto era il gas freddo che si librava sopra la superficie del liquido, che ha raffreddato piccoli campioni prima che arrivassero al liquido.

compagnia di Thorne, MiTeGen, alla fine ha sviluppato uno strumento di raffreddamento automatizzato per la cristallografia a raggi X, un altro metodo utilizzato per l'immagine di molecole proteiche, che rimuove il gas freddo appena prima che un campione venga immerso nell'azoto, e ha scoperto che le velocità di raffreddamento sono aumentate fino a sei volte più lente dell'etano. Il personale di MiTeGen ha quindi adattato il proprio strumento di raffreddamento per campioni crio-EM e ha collaborato con il personale del Cornell Center for Materials Research e il socio postdottorato Jonathan Clinger per raccogliere e analizzare i dati crio-EM.

Come riporta il nuovo studio, l'azoto si raffredda alla velocità perfetta per la preparazione del campione cryo-EM, abbastanza veloce da evitare una significativa formazione di cristalli di ghiaccio, ma abbastanza lento da ridurre in seguito il movimento indotto dal raggio.

"L'etano è eccessivo, " disse Thorne. "Per la velocità non hai bisogno, stai ottenendo immagini sfocate con movimento indotto dal raggio, e questo è più problematico di qualsiasi cristallo di ghiaccio che si forma da un raffreddamento leggermente più lento".

E raffreddamento ad azoto tutto liquido, Thorne ha detto, semplificherà i flussi di lavoro crio-EM, rimuovendo i passaggi aggiuntivi richiesti dall'etano e semplificando la progettazione di strumenti di raffreddamento automatizzati che soddisfino gli attuali standard di sicurezza di laboratorio.

"Questa è una bella illustrazione di come la scienza accademica di base - esaminare come i piccoli oggetti si raffreddano e come si forma il ghiaccio al loro interno - può portare a soluzioni pratiche e prodotti commerciali".