(Phys.org) - I ricercatori del Georgia Institute of Technology e dell'Università della California di San Francisco hanno la capacità avanzata degli scienziati di visualizzare un'immagine chiara di una singola struttura cellulare in movimento. Identificando le molecole utilizzando il rilevamento compresso, questo nuovo metodo fornisce la risoluzione spaziale necessaria più una risoluzione temporale più rapida di quanto fosse possibile in precedenza.

Nonostante molti successi nel campo della microscopia a super risoluzione negli ultimi anni con i progressi della risoluzione spaziale, l'imaging di cellule vive è rimasta una sfida a causa della necessità di un'elevata risoluzione temporale.

Ora, Lei Zhu, assistente professore presso la George W. Woodruff School of Mechanical Engineering della Georgia Tech, e Bo Huang, professore assistente presso il Dipartimento di Chimica Farmaceutica e il Dipartimento di Biochimica e Biofisica dell'UCSF, hanno sviluppato un approccio avanzato utilizzando la microscopia a super risoluzione per risolvere le caratteristiche cellulari di un ordine di grandezza inferiore a quello che si poteva vedere prima. Ciò consente ai ricercatori di attingere a informazioni precedentemente inaccessibili e rispondere a nuove domande biologiche.

La ricerca è stata pubblicata il 22 aprile 2012 sulla rivista Metodi della natura . La ricerca è finanziata dal National Institutes of Health, Programma UCSF per la ricerca biomedica rivoluzionaria, Borsa di studio Searle e borsa di studio Packard per la scienza e l'ingegneria.

La tecnologia precedente che utilizzava l'approccio a commutazione di singola molecola per la microscopia a super risoluzione dipende dalla diffusione di immagini di singole molecole in modo sparso in molti, spesso migliaia di, cornici della fotocamera. È estremamente limitato nella sua risoluzione temporale e non fornisce la capacità di seguire i processi dinamici nelle cellule vive.

“Ora possiamo usare la nostra scoperta usando la microscopia a super-risoluzione con una risoluzione temporale di secondi o addirittura meno di un secondo per un ampio campo visivo per seguire molti processi cellulari più dinamici, ” ha detto Zhu. "Gran parte della nostra conoscenza della vita di una cellula deriva dalla nostra capacità di vedere le piccole strutture al suo interno".

Huang ha notato, “Un'applicazione, Per esempio, è indagare come i mitocondri, la centrale elettrica della cellula, interagire con altri organelli e il citoscheletro per rimodellare la struttura durante il ciclo di vita della cellula”.

Attualmente, microscopia ottica, soprattutto nella forma moderna di microscopia a fluorescenza, è ancora usato frequentemente da molti biologi. Però, dicono gli autori, La microscopia ottica convenzionale ha un grande limite:l'incapacità di risolvere due oggetti più vicini della metà della lunghezza d'onda della luce a causa del fenomeno chiamato diffrazione. Con la diffrazione, le immagini appaiono sfocate e sovrapposte, non importa quanto sia alto l'ingrandimento utilizzato.

“Il limite di diffrazione è stato a lungo considerato uno dei vincoli fondamentali per la microscopia ottica fino alle recenti invenzioni delle tecniche di microscopia a fluorescenza a super risoluzione, ” ha detto Zhu. Metodi di microscopia a super risoluzione, come la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM) o la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM), si basano sulla capacità di registrare l'emissione di luce da una singola molecola nel campione.

Utilizzando molecole sonda che possono essere commutate tra uno stato visibile e uno invisibile, STORM/PALM determina la posizione di ogni molecola di interesse. Queste posizioni in definitiva definiscono una struttura.

La nuova scoperta è significativa, dissero Zhu e Huang, perché hanno dimostrato che la tecnologia consente di seguire la dinamica di un citoscheletro di microtubuli con una risoluzione temporale di tre secondi, che consentirebbe ai ricercatori di studiare i trasporti attivi di vescicole e altri carichi all'interno della cellula.

Utilizzando lo stesso sistema ottico e rivelatore della microscopia ottica convenzionale, la microscopia a super risoluzione richiede naturalmente tempi di acquisizione più lunghi per ottenere più informazioni spaziali, portando a un trade-off tra la sua risoluzione spaziale e temporale. Nei metodi di microscopia a super risoluzione basati su STORM/PALM, ogni immagine della telecamera campiona un sottoinsieme molto sparso di molecole di sonda nel campione.

Un approccio alternativo consiste nell'aumentare la densità dei fluorofori attivati ​​in modo che ogni fotogramma della fotocamera campioni più molecole. Però, questa alta densità di macchie fluorescenti fa sì che si sovrappongano, invalidando il metodo di localizzazione della singola molecola ampiamente utilizzato.

Gli autori hanno affermato che recentemente sono stati riportati numerosi metodi in grado di recuperare in modo efficiente le posizioni delle singole molecole anche quando i segnali dei singoli fluorofori si sovrappongono. Questi metodi si basano sull'adattamento di cluster di spot sovrapposti con un numero variabile di funzioni point-spread (PSF) con stima della massima verosimiglianza o statistica bayesiana. Il metodo bayesiano è stato applicato anche all'intero set di immagini.

Come risultato di nuove ricerche, Zhu e Huang presentano un nuovo approccio basato sull'ottimizzazione globale utilizzando il rilevamento compresso, che non comporta la stima o l'assunzione del numero di molecole nell'immagine. Mostrano che il rilevamento compresso può funzionare con densità molecolari molto più elevate rispetto ad altre tecnologie e dimostrano l'imaging cellulare dal vivo di microtubuli marcati con proteine ​​fluorescenti con una risoluzione temporale di tre secondi.

L'esperimento STORM utilizzato dagli autori, con microtubuli immunocolorati nelle cellule S2 di Drosophila melanogaster, dimostrato che i microtubuli vicini possono essere risolti mediante rilevamento compresso utilizzando solo 100 fotogrammi della fotocamera, mentre non erano distinguibili con il metodo di adattamento della singola molecola. Hanno anche eseguito STORM dal vivo su cellule S2 che esprimono stabilmente tubulina fusa a mEos2.

Al frame rate della fotocamera comunemente usato di 56,4 Hertz, è stato realizzato un filmato in super risoluzione con una risoluzione temporale di tre secondi (169 fotogrammi) e una risoluzione Nyquist di 60 nanometri, molto più velocemente di quanto riportato in precedenza, dissero Zhu e Huang. Questi risultati hanno dimostrato che il rilevamento compresso può consentire a STORM di monitorare i processi cellulari in tempo reale con una risoluzione temporale di seconda scala, o anche una risoluzione inferiore al secondo se è possibile utilizzare una fotocamera più veloce.