Luminescenza degli UCNP. un, Schema di upconversion del trasferimento di energia con Yb3+ come sensibilizzatore ed Er3+ come emettitore. B, Intensità minime di eccitazione di picco della luce NIR necessarie per l'imaging multifotone di singole molecole di varie classi di sonde luminescenti. Gli intervalli di intensità di eccitazione di picco mostrati sono necessari per rilevare segnali di 100 c.p.s. Credito:per gentile concessione di Daniel Gargas, Emory Chan, Bruce Cohen, e P. James Schuck, La Fonderia Molecolare, Laboratorio Nazionale Lawrence Berkeley
Quando si esegue l'imaging a livello di singola molecola, diventano evidenti piccole irregolarità note come eterogeneità, caratteristiche che si perdono in le cosiddette immagini d'insieme. Allo stesso tempo, fino a poco tempo fa è stato difficile sviluppare sonde luminescenti con la fotostabilità, luminosità ed emissione continua necessarie per la microscopia a singola molecola. Ora, però, scienziati della Molecular Foundry del Lawrence Berkeley National Lab, Berkeley, CA hanno sviluppato nanoparticelle in aumento (UCNP) di diametro inferiore a 10 nm la cui luminosità nell'imaging a particella singola supera quella dei materiali esistenti di oltre un ordine di grandezza. I ricercatori affermano che i loro risultati rendono possibile una gamma di applicazioni, compreso cellulare e in vivo immagini, oltre a riferire sulle proprietà del campo vicino elettromagnetico locale di nanostrutture complesse.
Il Dr. P. James Schuck ha discusso il documento che lui, Dott. Bruce E. Cohen, Dott. Daniel J. Gargas, Dott. Emory M. Chan, e i loro coautori pubblicati in Nanotecnologia della natura , a partire dalle principali sfide che gli scienziati hanno incontrato in:
"Gli emettitori più comuni utilizzati per l'imaging di singole molecole - coloranti organici e punti quantici - presentano limitazioni significative che si sono dimostrate estremamente difficili da superare, " Schuck dice a Phys.org. Spiega che i coloranti organici sono generalmente le sonde più piccole (in genere ~ 1 nm di dimensione), e si accenderà e si spegnerà casualmente. Questo "lampeggio" è piuttosto problematico per l'imaging a singola molecola, lui continua, e in genere dopo aver emesso circa 1 milione di fotoni sarà sempre photobleach - questo è, spegnere definitivamente. "All'inizio potrebbero sembrare molti fotoni, "Schuck dice, "ma questo significa che i coloranti smettono di emettere dopo solo circa 1-10 secondi nella maggior parte delle condizioni di imaging. Gli UCNP non lampeggiano mai".
Inoltre, Schuck continua, si scopre che esistono gli stessi problemi per i punti quantici fluorescenti, o Qdots , anche. Però, mentre è possibile creare Qdot che non lampeggeranno o non si fotocandeggeranno, questo di solito richiede l'aggiunta di strati al Qdot, che li rende troppo grandi per molte applicazioni di imaging. (Un punto quantico è un nanocristallo semiconduttore abbastanza piccolo da esibire proprietà meccaniche quantistiche.) "I nostri nuovi UCNP sono piccoli, e non sbattere le palpebre o candeggiare."
A causa di queste proprietà, lui nota, Gli UCNP hanno recentemente generato un interesse significativo perché hanno il potenziale per essere etichette e sonde luminescenti ideali per l'imaging ottico, ma il principale ostacolo alla realizzazione del loro potenziale è stata l'incapacità di progettare UCNP sub-10 nm abbastanza luminosi da essere ripresi al singolo- livello UCNP.
Intensità ed eterogeneità della luminescenza dipendenti dalle dimensioni dell'UCNP. un, Deviazione della singola intensità di luminescenza UCNP normalizzata al volume delle particelle dalla scala volumetrica ideale (n¼300 totale). La curva rappresenta l'intensità calcolata normalizzata al volume per UCNP con uno strato superficiale non luminescente di 1,7 nm. Solo intensità da singolo, nanocristalli non aggregati, come determinato dalla Fig. 5 supplementare, sono utilizzati. Il riquadro in alto mostra un diagramma che rappresenta un nanocristallo ideale in cui tutti gli emettitori inclusi sono luminescenti (cerchi verdi). L'inserto inferiore è un diagramma che rappresenta un nanocristallo con emettitori non luminescenti (cerchi marroni) in uno strato superficiale esterno. B, Spettri fini delle bande di emissione verde raccolti da quattro singoli UCNP da 8 nm (curve 1–4) e loro spettri medi (curva Sigma). Credito:per gentile concessione di Daniel Gargas, Emory Chan, Bruce Cohen, e P. James Schuck, La Fonderia Molecolare, Laboratorio Nazionale Lawrence Berkeley
"Questo mi porta a quello che è probabilmente l'aspetto più importante del nostro lavoro, che è la scoperta e la dimostrazione di nuove regole per la progettazione di ultrabright, sonde a molecola singola UCNP ultrapiccole, " dice Schuck. Inoltre, sottolinea che queste nuove regole contrastano direttamente con i metodi convenzionali per la creazione di UCNP luminosi. "Come abbiamo mostrato nel nostro articolo, abbiamo sintetizzato e ripreso UCNPs piccoli come una singola proteina fluorescente! Per molte applicazioni di bioimmagine, sono necessarie sonde luminescenti molto piccole, sicuramente inferiori a 10 nm, perché è davvero necessaria l'etichetta o la sonda per perturbare il sistema che stanno sondando il meno possibile."
Schuck menziona un altro vantaggio della conversione delle nanoparticelle, vale a dire, operano assorbendo due o più fotoni infrarossi ed emettendo luce visibile ad energia più elevata. "Poiché quasi tutti gli altri materiali non si convertono, durante l'imaging degli UCNP in un campione, non c'è quasi nessun altro fondo autofluorescente proveniente dal campione. Ciò si traduce in un buon contrasto dell'immagine e ampi livelli di segnale-sfondo." Inoltre, mentre i coloranti organici e i Qdot possono anche assorbire la luce IR ed emettere luce ad energia più elevata tramite un processo di assorbimento non lineare di due o più fotoni, i poteri di eccitazione necessari per generare segnali di fluorescenza a due fotoni misurabili in coloranti e piccoli Qdot sono molti ordini di grandezza superiori a quelli necessari per generare luminescenza convertita da UCNP. "Questi poteri elevati sono generalmente dannosi per i campioni e rappresentano una grande preoccupazione per le comunità di bioimmagini", sottolinea Schuck, "dove possono portare a danni e morte cellulare".
Schuck osserva che altri due aspetti chiave centrali per le scoperte menzionate nel documento:l'utilizzo della caratterizzazione avanzata delle singole particelle, e modelli teorici – erano una conseguenza dell'ambiente collaborativo multidisciplinare della Fonderia. "Questo studio ci ha richiesto di combinare la fotofisica della singola molecola, la capacità di sintetizzare nanocristalli ultrapiccoli upconverting di quasi tutte le composizioni, e la modellazione e simulazione avanzate delle proprietà ottiche dell'UCNP, " dice. "Simulare e modellare accuratamente il comportamento fotofisico di questi materiali è impegnativo a causa del gran numero di livelli di energia in questi materiali che interagiscono tutti in modi complessi, ed Emory Chan ha sviluppato un modello unico che rappresenta oggettivamente tutti gli over 10, 000 transizioni da collettore a collettore nell'intervallo di energia consentito."
In precedenza, Schuck afferma che la saggezza convenzionale per la progettazione di UCNP luminosi era quella di utilizzare una concentrazione relativamente piccola di ioni emettitori nelle nanoparticelle, poiché troppi emettitori porteranno a una luminosità inferiore a causa degli effetti di autospegnimento una volta che la concentrazione dell'emettitore UCNP supera ~ 1%. "Questo risulta essere vero se si desidera creare particelle luminose in condizioni di imaging di insieme, ovvero, dove viene utilizzata una potenza di eccitazione relativamente bassa - poiché hai molte particelle che segnalano collettivamente, " Schuck spiega. "Tuttavia, questo si rompe in condizioni di imaging a singola molecola." Nel loro articolo, i ricercatori hanno dimostrato che sotto i maggiori poteri di eccitazione utilizzati per l'imaging di singole particelle, i relativi livelli energetici si saturano e l'autospegnimento si riduce. "Perciò, "Schuck continua, "vuoi includere nei tuoi UCNP una concentrazione più alta possibile di ioni emettitori". Ciò si traduce nel fatto che le nanoparticelle sono quasi non luminescenti in condizioni di insieme a bassa potenza di eccitazione a causa di un significativo auto-estinguente, ma ultra brillante in condizioni di imaging a singola molecola.
Setup sperimentale per la caratterizzazione ottica di singoli UCNP. Un laser da 980 nm viene messo a fuoco con un obiettivo da 500 mm prima di entrare nell'apertura posteriore di un obiettivo 0,95 NA 100x (Zeiss), che avvicina il piano focale del laser a quello della luminescenza visibile (linea tratteggiata). La luce emessa viene raccolta di nuovo attraverso lo stesso obiettivo, filtrato da due filtri passa-corto da 700 nm e due filtri passa-lungo da 532 nm (Chroma) per rimuovere la luce laser residua, e focalizzato su un singolo APD a conteggio di fotoni (MPD) o indirizzato a uno spettrometro CCD raffreddato a LN (Princeton Instruments) con un reticolo di 1200 scanalature/mm. Un contatore di fotoni singoli correlato al tempo (Picoquant) viene utilizzato per le misurazioni della durata della luminescenza. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in condizioni ambientali a 106/cm2 se non diversamente indicato. I dati dipendenti dalla potenza e i tagli di linea delle singole particelle mostrati in Fig 4 sono stati raccolti con un obiettivo a immersione in olio 1.4 NA 100x (Nikon). Credito:per gentile concessione di Daniel Gargas, Emory Chan, Bruce Cohen, e P. James Schuck, La Fonderia Molecolare, Laboratorio Nazionale Lawrence Berkeley
Un'altra importante implicazione di questa scoperta, Schuck aggiunge, è che dovrebbe cambiare il modo in cui le persone esamineranno le migliori sonde luminescenti a singola molecola in futuro. "Fino ad ora, " fa notare, "Le persone dovrebbero prima guardare per vedere quali sonde erano luminose usando condizioni a livello di insieme, quindi indagherebbe solo quel sottoinsieme come possibili sonde a singola molecola. Le nostre nuove sonde sarebbero, Certo, hanno fallito quel test di screening!"
Schuck sottolinea ancora una volta che "una ragione fondamentale per cui questa scoperta è avvenuta è che abbiamo esperti in tutte le aree chiave nello stesso edificio, e siamo stati in grado di iterare rapidamente attraverso il ciclo teoria-sintesi-caratterizzazione."
Per quanto riguarda le future direzioni di ricerca, osserva Schuck, gli scienziati stanno perseguendo alcune strade diverse. "Vorremmo certamente utilizzare questi UCNP di nuova concezione per il bioimaging... fino ad ora, abbiamo studiato le proprietà fotofisiche fondamentali di queste particelle solo quando sono isolate su vetro. Riteniamo che un'applicazione entusiasmante e importante sarà il loro uso nell'imaging cerebrale, in particolare per i tessuti profondi in vivo imaging ottico dei neuroni e della funzione cerebrale.
In chiusura, Schuck cita altre aree di ricerca che potrebbero trarre beneficio dal loro studio. "Penso che un'applicazione primaria sia nel tracciamento di singole particelle all'interno delle celle. Ad esempio, "illustra, "etichettatura di proteine specifiche con singoli UCNP e loro monitoraggio per comprendere la loro cinetica cellulare".
Lungo linee diverse, Schuck aggiunge, si scopre che gli UCNP sono anche ottime sonde di campi elettromagnetici molto locali. "Questo perché i lantanidi hanno un insieme piuttosto unico di proprietà fotofisiche come l'emissione di dipolo magnetico relativamente prevalente, permettendoci di sondare campi magnetici ottici, e tempi di vita molto lunghi tali che le transizioni non sono fortemente consentite, che ci consente di sondare più facilmente gli effetti ottici quantistici della cavità come il miglioramento dell'emissione di Purcell. Infatti, Schuck conclude, è appena in corso un esperimento che utilizza gli UCNP per riferire sui punti di forza del campo vicino e sulle distribuzioni di campo che circondano i dispositivi nanoplasmonici".
© 2014 Phys.org
