Nella biosintesi dell'eme, la fase terminale è l'inserimento del ferro ferroso nella protoporfirina IX (PPIX) da parte dell'enzima ferrochelatasi. In condizioni fisiologiche, si formano anche piccole quantità di zinco protoporfirina IX (ZnPP). Le concentrazioni di ZnPP e PPIX nelle cellule eritroidi sono tipicamente alterate da condizioni che influenzano la disponibilità di ferro ferroso, aumentare le quantità di PPIX, o diminuire l'attività enzimatica della ferrochelatasi. Sfortunatamente, il metodo di quantificazione standard basato su HPLC è lungo e complicato. alternative, pure, si sono rivelati tecnicamente troppo impegnativi o ingombranti per l'adozione generale. Per la misurazione del solo ZnPP, un fluorimetro frontale portatile, l'ematofluorimetro, è disponibile in commercio. Ancora, il suo utilizzo è limitato da un'elevata fluorescenza di fondo di altri costituenti del sangue che rende inevitabile il lavaggio del campione.
Un team di ricerca guidato da Georg Hennig della Klinikum der Universität München (Germania) ha ora sviluppato un nuovo metodo per la quantificazione simultanea di ZnPP e PPIX in campioni di sangue non lavati. Si basa sull'eccitazione a doppia lunghezza d'onda per eliminare efficacemente la fluorescenza di fondo da altri costituenti del sangue. I risultati ottenuti sono stati strettamente correlati con le determinazioni mediante un test HPLC di riferimento.
La chiave del successo è stata la scelta delle lunghezze d'onda di eccitazione appropriate. Entrambi dovrebbero subire un assorbimento praticamente identico e la loro separazione spettrale dovrebbe essere piccola, in modo che le profondità di penetrazione dei fotoni siano essenzialmente le stesse. L'efficienza di eccitazione dei fluorofori responsabili dell'autofluorescenza dovrebbe differire solo di una piccola quantità tra le due lunghezze d'onda di eccitazione, in modo che la sottrazione degli spettri di emissione elimini efficacemente l'autofluorescenza. In contrasto, il fluoroforo dell'analita dovrebbe mostrare una grande differenza nell'efficienza di eccitazione tra queste due lunghezze d'onda di eccitazione, in modo che la differenza tra gli spettri di emissione sia grande e non elimini il segnale del fluoroforo dell'analita.
Questo è il caso di 425 nm (il massimo di eccitazione della fluorescenza ZnPP, massimo di emissione a 593 nm) e 407 nm come lunghezza d'onda corrispondente con identico assorbimento dell'eme ossigenato, ma efficienza di eccitazione ZnPP sostanzialmente inferiore. Inoltre, poiché la lunghezza d'onda di eccitazione a 407 nm si avvicina al massimo di eccitazione PPIX a 397 nm, lo spettro di emissione mostra un pronunciato picco di emissione di fluorescenza PPIX, che si trova a 627 nm. Poiché l'efficienza di eccitazione PPIX è molto più bassa a 425 nm, il picco di emissione di fluorescenza PPIX non viene eliminato nello spettro differenza e può essere valutato insieme al segnale ZnPP.
Il nuovo approccio potrebbe essere implementato in modo semplice ed economico in un dispositivo da utilizzare in condizioni di campo. Inoltre, potrebbe ridurre l'autofluorescenza in tessuti come la mucosa orale in vivo, consentendo misurazioni non invasive di ZnPP e PPIX. (Testo fornito da K. Maedefessel-Herrmann)
