La visualizzazione delle cellule biologiche al microscopio è stata appena resa più chiara, grazie alla ricerca condotta dallo studente laureato Yifei Jiang e dal ricercatore principale Jason McNeill del dipartimento di chimica della Clemson University.

Con l'aiuto di Rhonda Powell e Terri Bruce della Light Imaging Facility di Clemson, il team è stato in grado di sviluppare un "interruttore" di nanoparticelle che emette fluorescenza per affinare la risoluzione delle immagini microscopiche che raffigurano piccole strutture cellulari. Come recentemente pubblicato in Nano lettere , questo interruttore migliora un metodo di imaging che ha vinto il Premio Nobel per la Chimica nel 2014.

Poiché le strutture cellulari emettono luce a lunghezze d'onda inferiori a 400-700 nanometri nello spettro elettromagnetico, spesso appaiono sfocate al microscopio ottico. Questo vincolo è detto limite di diffrazione, e si verifica a causa delle proprietà ondulatorie della luce. Quando la luce passa intorno alle strutture all'interno delle cellule biologiche, si diffrange, o si piega, a un punto che i microscopi ottici non possono risolvere chiaramente. Il metodo di imaging vincitore del premio 2014 - microscopia di localizzazione di singole molecole - è stato inventato per superare questa limitazione.

"La microscopia di localizzazione di singole molecole si basa su 'fotointerruttori' molecolari - molecole fluorescenti che puoi accendere e spegnere, come un interruttore della luce, per superare il limite di diffrazione, " ha detto McNeill. "Con questo metodo di imaging, il campione viene ripreso una molecola fluorescente alla volta e viene utilizzato un computer per costruire un'immagine molto più nitida di quella che si potrebbe ottenere con un normale microscopio ottico".

La presa, però, è che la fluorescenza fornita dai fotointerruttori è al massimo debole, con solo un leggero miglioramento nella risoluzione dell'immagine. La microscopia di localizzazione di singole molecole richiede anche attrezzature specializzate che possono essere costose da ottenere.

Indica il "buckyswitch" - la versione avanzata dei ricercatori di Clemson di un photoswitch. Questo nuovo tipo di nanoparticelle mantiene la capacità on-off del fotointerruttore, ma è 10 volte più luminoso e più facile da usare. Consente inoltre ai microscopi di acquisire immagini fino al livello terapixel. (È l'equivalente di un trilione di pixel, o un milione di megapixel.)

"Queste nanoparticelle sono i primi fotointerruttori a raggiungere una precisione fino a circa 1 nanometro, che migliora notevolmente la risoluzione dell'imaging a super risoluzione, " Jiang ha detto. "Inoltre, il nostro metodo richiede solo una sorgente luminosa di eccitazione, dove le tecniche convenzionali di super-risoluzione richiedono due laser; così, abbiamo semplificato la configurazione del microscopio."

Jiang ha assemblato l'interruttore da una lampada fluorescente, polimero coniugato semiconduttore complessato con un derivato chimico del buckminsterfullerene:una forma di carbonio a forma di pallone da calcio.

"La parte difficile della creazione di una nanoparticella fluorescente che puoi accendere e spegnere è che ci sono molte aree che emettono fluorescenza contemporaneamente, " ha detto McNeill. "Nel caso del polimero coniugato fluorescente, ci sono dozzine o centinaia di segmenti di catena. Puoi provare a fare molti piccoli cambi per ogni segmento, ma è difficile farli spegnere tutti contemporaneamente. Non puoi sincronizzarli."

Aggiungendo il derivato di buckminsterfullerene, chiamato PCBM, alla realizzazione di buckyswitch, si forma un "interruttore generale" che regola la carica atomica dei segmenti del polimero, sincronizzando così la fluorescenza. PCBM è in grado di catturare elettroni dal segmento polimerico, conferendo al segmento una carica complessiva positiva. Questa carica positiva riduce la fluorescenza dei segmenti vicini, che ha un effetto domino che spegne la fluorescenza nell'intera nanoparticella.

Bruce - il cui background attraversa i temi dell'ingegneria chimica, biologia applicata, biologia cellulare, ed esperienza nell'insegnamento e nell'industria - paragona questo metodo di imaging alla vista di un ponte sospeso di notte.

"I fili del ponte sono spesso illuminati, e quando sarai lontano dal ponte, le luci sembrano una continua 'corda' di luce, invece delle singole lampadine. Però, se riesci a far lampeggiare le lampadine - in modo che solo una lampadina su due sia "accesa" in qualsiasi momento - i tuoi occhi possono distinguere le singole lampadine da lontano, " Bruce ha detto. "La base per la microscopia a super risoluzione risiede nella capacità di far lampeggiare le etichette fluorescenti proprio come le luci sul ponte. Il lavoro che sta facendo il laboratorio del Dr. McNeill è vitale per il progresso di questa tecnologia perché si concentra sul rendere quegli ammiccamenti individuali molto più luminosi, in modo che i nostri attuali rilevatori di fotoni possano effettivamente vedere i lampeggi. Se riusciamo a vedere i lampeggi con una fotocamera o un altro rilevatore di fotoni, possiamo mappare dove si verifica il battito di ciglia, e creare un'immagine in cui possiamo discernere due punti di luce che si trovano entro 10-20 nanometri l'uno dall'altro".

Una volta che il buckyswitch è stato sintetizzato, Jiang lo ha testato su E. coli, ma non prima di aver sviluppato un mezzo di crescita unico per i batteri. Tipicamente, E. coli viene coltivato in terreni autofluorescenti, il che significa che emette luce naturalmente. Senza i mezzi adeguati, la fluorescenza del buckyswitch sarebbe oscurata dalla luce di fondo, qualcosa che Powell ha sottolineato.

"Uno studio come quello condotto da Yifei richiedeva pochissima fluorescenza di fondo, quindi ho ricercato i componenti dei media che avrebbero meno probabilità di essere autofluorescenti e ho preparato una "ricetta" per un non convenzionale, mezzi nutritivi meno autofluorescenti per la coltura dei batteri, " disse Powell, che ha studiato sia scienze biologiche che microbiologia alla Clemson prima di diventare il responsabile del laboratorio di ricerca della Clemson Light Imaging Facility. Powell e Bruce hanno anche lavorato per fornire a Jiang l'E. coli per lo studio.

Dopo che tutti i componenti necessari sono stati squadrati, Jiang ha attaccato gli interruttori bucky a nanoparticelle alla superficie di E. coli. Come sperato, i buckyswitch emettevano piccoli lampi di luce, che ha permesso ai ricercatori di determinare le loro posizioni precise. Hanno poi messo insieme ogni lampo di luce per ricostruire la forma dell'E. coli, ottenendo un'immagine ad altissima risoluzione.

"Speriamo che questa svolta possa alla fine aiutare i ricercatori ad affrontare problemi difficili in biologia, portando a scoperte rivoluzionarie nella comprensione e nel trattamento delle malattie, " ha detto il team di Clemson.

Il team ha progettato gli interruttori bucky per funzionare con microscopi fluorescenti standard e software gratuito disponibile online, rendendo la tecnologia poco costosa e accessibile per i laboratori di tutto il mondo.

La loro pubblicazione, intitolato "Imaging a superrisoluzione migliorato utilizzando il rumore del telegrafo nelle nanoparticelle di semiconduttori organici, " è apparso nel numero del 14 giugno di Nano lettere .