I nodi sono strumenti indispensabili per attività umane come la vela, pesca e arrampicata su roccia, (per non parlare di, allacciare le scarpe). Ma facendo un nodo in un filo di DNA simile a un pizzo, misurando appena miliardesimi di metro di lunghezza, richiede pazienza e competenze altamente specializzate.

Hao Yan, un ricercatore dell'ASU, è una mano esperta in questo campo delicato ed esotico, operando al crocevia tra nanotecnologie e belle arti.

In una nuova ricerca apparsa sulla rivista Comunicazioni sulla natura , Yan e i suoi colleghi Fei Zhang, Xiaodong Qi e altri descrivono un metodo per indurre segmenti di DNA a filamento singolo in complesse strutture annodate in 2 e 3 dimensioni.

I risultati rappresentano un importante progresso nel campo frenetico della nanotecnologia del DNA, in cui la molecola della vita viene utilizzata come materiale da costruzione strutturale per una vasta gamma di minuscole configurazioni. Tra questi ci sono minuscoli dispositivi robotici, applicazioni fotoniche, sistemi di somministrazione dei farmaci, porte logiche, così come le applicazioni diagnostiche e terapeutiche.

"Le strutture annodate del DNA dimostrate in questo lavoro mostrano una complessità topologica senza precedenti, ben oltre ciò che è stato raggiunto prima di utilizzare la piegatura a singolo filamento, " Yan dice. "In effetti, non è solo sorprendente, ma anche sorprendente che il DNA e l'RNA a singolo filamento possano passare attraverso le proprie catene e trovare un modo per formare strutture così altamente annodate, dato il fatto che il singolo filo deve tessere attraverso tanti grovigli."

Yan dirige il Biodesign Center for Molecular Design and Biomimetics ed è Martin D. Glick Distinguished Professor presso la School of Molecular Sciences dell'ASU.

Portare il DNA nella piega

Il nuovo studio prevede innovazioni nel campo degli origami del DNA, quale, come il nome suggerisce, utilizza acidi nucleici come DNA e RNA per ripiegarsi e autoassemblarsi in forme complesse. Ciò si verifica quando le basi nucleotidiche complementari nell'alfabeto di 4 lettere del DNA entrano in contatto e si legano, secondo un rigido regime:le basi C si accoppiano sempre con G e le basi A si accoppiano sempre con T.

In natura, stringhe di acidi nucleici forniscono il codice necessario per creare proteine ​​complesse. Questa biologia di base fornisce la base per tutta la vita terrena. Sfruttando le semplici proprietà di accoppiamento delle basi del DNA, è possibile progettare strutture che si autoassemblano in laboratorio. Il metodo è stato applicato a forme di DNA sia a singolo filamento che a doppio filamento, con conseguente nanostrutture di crescente complessità e raffinatezza.

Mentre l'origami del DNA ha fatto progressi sorprendenti sin dal suo inizio, un'innovazione tecnica è stata terribilmente difficile da raggiungere. Fino ad ora, la creazione di complesse strutture annodate nel DNA in modo prevedibile e programmabile è sfuggita ai ricercatori.

Il nuovo lavoro supera questo ostacolo, stabilendo precise regole di progettazione che consentano ai segmenti a filamento singolo di DNA (o RNA) che vanno da 1800-7500 nucleotidi di formare nanostrutture simili a nodi con numeri di attraversamento (dove il filamento di DNA si intreccia dentro e fuori la propria lunghezza) che vanno da 9 a 57 .

Il gruppo ha inoltre dimostrato che queste nanostrutture di acidi nucleici possono essere replicate e amplificate, sia in condizioni di laboratorio che all'interno di sistemi viventi.

I nodi della natura

Strutture annodate, come quelli che Yan ha fabbricato, (ma molto più semplici di quelli sintetici), hanno correlati nel mondo naturale. Sono stati osservati nel DNA e nelle proteine ​​e generalmente si formano durante la replicazione e la trascrizione, (quando una sequenza di DNA viene copiata in RNA messaggero). Possono anche verificarsi nei genomi dei fagi, virus che infettano le cellule batteriche.

Tuttavia, la costruzione di nodi molecolari su scala nanometrica, visualizzare geometrie ben definite e coerenti richiede un enorme controllo e precisione. Come succede, gli acidi nucleici come il DNA sono ideali per la progettazione e la sintesi di tali nodi molecolari.

In precedenza, lunghezze di DNA a doppio filamento sono state utilizzate per costruzioni su nanoscala, con l'aggiunta di pezzi corti o "fili di graffetta" per fissare insieme le strutture risultanti. Il nuovo studio utilizza invece un unico tratto di DNA progettato per avvolgersi su se stesso in modo preciso, sequenza di passaggi preprogrammata.

Una volta che le nanostrutture di DNA annodate si sono assemblate con successo, sono ripresi utilizzando la microscopia a forza atomica. Un calcolo accurato consente ai ricercatori di ottimizzare i percorsi di piegatura per produrre la massima resa per ogni struttura sintetica. L'uso di DNA a singolo filamento anziché a doppio filamento consente di produrre strutture in abbondanza a costi molto inferiori.

Un approccio a singolo filamento apre le porte alla progettazione di nanoarchitetture con specifiche, funzioni ben definite, che può essere prodotto attraverso cicli successivi di evoluzione in vitro, dove gli attributi desiderati vengono selezionati in un processo ripetitivo di raffinamento. Ulteriore, l'approccio delineato nel nuovo studio fornisce una piattaforma generale per la progettazione di strutture molecolari di dimensioni maggiori e complessità senza precedenti, aprendo la strada ai progressi della nanofotonica, consegna farmaci, analisi crio-EM e archiviazione della memoria basata sul DNA.

DNA designer (e RNA)

Per uno dei progetti iniziali del nodo, la strategia sviluppata da Yan e dai suoi colleghi prevedeva l'infilatura di un singolo filamento di DNA o RNA attraverso se stesso 9 volte secondo una sequenza preprogrammata, dimostrando che il nuovo metodo è in grado di produrre forme geometriche complesse programmabili, replicabile e scalabile.

La strategia di progettazione è stata successivamente ampliata per includere strutture di RNA a filamento singolo e nodi di DNA 3-D, le cui forme sono state ricostruite mediante una tecnica nota come microscopia elettronica a trasmissione criogenica, confermando la loro corretta piegatura nelle forme desiderate.

"Una delle sfide in questo lavoro è come aumentare la resa di assemblaggio di strutture molto annodate". Ha detto Fei. A differenza delle classiche nanostrutture di DNA, i nodi a filamento singolo sono meno tolleranti in termini di preciso ordine di piegatura a causa della complessità topologica. Se un singolo incrocio viene piegato male durante il processo, l'errore difficilmente verrà autocorretto e la maggior parte delle piegature errate rimarranno nella struttura completata. "Abbiamo sviluppato una strategia di piegatura gerarchica per guidare la corretta formazione dei nodi. Abbiamo confrontato l'efficienza di piegatura di un nodo con 23 incroci utilizzando diversi percorsi di piegatura. Le immagini AFM hanno mostrato un drammatico aumento della resa di piegatura delle strutture ben formate da 0,9 % al 57,9% applicando un percorso di piegatura gerarchico ottimizzato." Fei ha aggiunto.

Le regole progettuali utilizzate per ottimizzare i percorsi pieghevoli si basano sul numero di punti di attraversamento, la lunghezza del DNA e il numero di coppie di basi nella struttura progettata. Sono state stabilite tre regole principali. Primo, i percorsi pieghevoli lineari sono risultati preferibili ai percorsi ramificati. Secondo, la sezione spiegata di un filamento di DNA non dovrebbe passare attraverso se stessa nelle prime fasi quando il filamento è ancora lungo. Finalmente, i bordi della forma desiderata che hanno tre incroci dovrebbero piegarsi prima di quelli con due incroci.

Seguendo la strategia progettuale, il team è stato in grado di creare nodi di DNA più complessi con numeri di attraversamento crescenti.

Catene più lunghe di DNA a filamento singolo pongono sfide uniche per la progettazione di nanostrutture programmate a causa della maggiore probabilità di autocomplementarità involontaria delle basi che compongono la catena. Una struttura del nodo del DNA che vanta 57 nodi incrociati assemblati con successo, anche se con minor resa e minor precisione. Quando il numero di attraversamenti è stato aumentato a 67, la resa è notevolmente diminuita e le strutture risultanti, ripreso da AFM, ha mostrato più errori di montaggio.

Lo studio riporta i più grandi nodi di DNA mai assemblati, formato da un massimo di 7.5k basi, con le topologie più complicate, con un massimo di 57 regioni di attraversamento. Le sequenze di DNA a filamento singolo possono essere prodotte in serie in cellule viventi per una maggiore efficienza a costi inferiori. In definitiva, All'interno delle cellule possono formarsi nanostrutture di DNA con funzioni diverse, innovazioni da perseguire nei lavori futuri.