L'assorbimento di tre fotoni (3PA) è un processo ottico non lineare che comporta l'assorbimento simultaneo di tre fotoni per eccitare un elettrone dallo stato fondamentale a uno stato energetico più elevato. Questo processo è in genere molto più debole dell’assorbimento di un fotone (1PA) e dell’assorbimento di due fotoni (2PA), ma può essere notevolmente migliorato in alcuni materiali, come i nanocristalli semiconduttori e i coloranti organici.

3PA presenta diversi potenziali vantaggi per il bioimaging rispetto a 1PA e 2PA. Innanzitutto, il 3PA può fornire una penetrazione tissutale più profonda perché la luce a lunghezza d’onda maggiore utilizzata per il 3PA è meno dispersa e assorbita dai componenti tissutali come acqua ed emoglobina. In secondo luogo, il 3PA può essere utilizzato per eccitare la fluorescenza in molecole specifiche con elevata selettività perché la lunghezza d'onda di eccitazione può essere regolata con precisione per adattarsi allo spettro di assorbimento della molecola bersaglio. In terzo luogo, 3PA può generare immagini a risoluzione più elevata perché il volume focale più piccolo utilizzato per la microscopia 3PA comporta un minor fotosbiancamento e fotodanneggiamento del campione.

Nonostante questi potenziali vantaggi, il 3PA non è ancora ampiamente utilizzato per il bioimaging a causa di diverse sfide. Innanzitutto, l’efficienza del 3PA è tipicamente molto bassa e richiede elevate potenze laser che possono danneggiare i campioni biologici. In secondo luogo, la lunghezza d’onda di eccitazione del 3PA è spesso nella gamma degli ultravioletti (UV), che può essere dannosa per le cellule. In terzo luogo, lo sviluppo di sonde 3PA adeguate è ancora nelle fasi iniziali.

Una volta superate queste sfide, è probabile che il 3PA diventi uno strumento più importante per il bioimaging. La sua combinazione unica di penetrazione nei tessuti profondi, alta selettività e alta risoluzione lo rendono ideale per una varietà di applicazioni, tra cui l'imaging in vivo, il trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) e la microscopia a super risoluzione.

Ecco alcuni esempi specifici di come il 3PA è stato utilizzato per il bioimaging:

*La microscopia 3PA è stata utilizzata per visualizzare i vasi sanguigni nel cervello di un topo vivente. Il segnale 3PA è stato generato da un colorante fluorescente che è stato specificamente assorbito dalle cellule endoteliali, le cellule che rivestono i vasi sanguigni. Questo studio ha dimostrato il potenziale del 3PA per l'imaging in vivo delle strutture dei tessuti profondi.

* 3PA FRET è stato utilizzato per studiare le interazioni proteiche nelle cellule vive. In questa tecnica, due diversi coloranti fluorescenti sono attaccati a due diverse proteine ​​di interesse. Quando le proteine ​​interagiscono, i coloranti si avvicinano e il segnale 3PA da un colorante viene trasferito all'altro colorante. Ciò consente ai ricercatori di monitorare le interazioni proteiche in tempo reale e con un'elevata risoluzione spaziale.

* La microscopia a super risoluzione 3PA è stata utilizzata per visualizzare strutture in cellule con una risoluzione inferiore a 100 nanometri. Questa tecnica combina l'alta risoluzione della microscopia 3PA con le capacità di super-risoluzione di tecniche come la microscopia a deplezione ad emissione stimolata (STED) e la microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM).

Questi esempi dimostrano il potenziale del 3PA per il bioimaging. Una volta superate le sfide associate al 3PA, è probabile che questa tecnica diventi sempre più importante per una varietà di applicazioni nella ricerca biomedica e nella diagnostica clinica.