Nella biologia molecolare, una buona scelta del tampone e la preparazione per le diverse fasi di isolamento del DNA possono fare la differenza tra il passaggio all'espressione proteica o l'apertura di un altro kit maxi-prep per ricominciare. Nonostante la loro importanza cruciale, le ricette tampone sono spesso proprio questo: ricette scritte senza spiegazioni o motivazioni per i diversi componenti. Uno di questi tamponi è il glucosio-tris-EDTA o il tampone GTE.
A cosa serve GTE?
GTE è usato per risospendere i pellet di cellule batteriche prima di lisare (rompere) le cellule e raccogliere il DNA plasmidico dentro. Il lisozima, che ammorbidisce le membrane cellulari, viene spesso aggiunto insieme al tampone GTE. Ottenere una sospensione omogenea di cellule intere durante questo passaggio in modo che la soluzione di lisi successivamente aggiunta possa raggiungere tutte le cellule è la chiave per ottenere buoni rendimenti di DNA. GTE è progettato per fare questo, fornendo allo stesso tempo un ambiente stabile per il DNA.
Glucosio per l'osmolarità
50mM (millimolare) di zucchero glucosio viene aggiunto al tampone GTE per mantenere l'osmolarità dove la concentrazione di soluto all'esterno delle cellule è vicino a quello all'interno delle cellule. Ciò impedisce la lisi precoce delle cellule, che può causare basse rese di DNA a causa dell'aggregazione e del degrado. Anche gli altri componenti del tampone contribuiscono all'osmolarità della soluzione, ma il glucosio, essendo un non elettrolita, è una buona scelta perché non interferisce con le proprietà del tampone della soluzione.
Tris per stabilità del pH
Tris è il nome breve di tris (idrossimetil) aminometano, che è un tampone di pH molto comune. Nel caso del tampone GTE, il sale acido (Tris-HCl) viene aggiunto al tampone ad una concentrazione di 25 mM. Ciò mantiene il pH della soluzione a un 8.0 quasi fisiologico, un pH ideale per prevenire l'idrolisi acida (degradazione) del DNA plasmidico e reazioni collaterali indesiderate degli altri componenti cellulari.
EDTA Previene la degradazione del DNA
L'EDTA, o acido etilendiamminotetraacetico, cattura o "chela" gli ioni metallici dalla soluzione, impedendo loro di partecipare a reazioni collaterali indesiderate. Nel buffer GTE, EDTA viene aggiunto a 10mM. Il suo scopo principale è nel buffer di arrotondare lo zinco, il magnesio e il calcio liberi, prevenendo in tal modo la degradazione del DNA da alcuni percorsi che richiedono quei metalli.
Alcuni consigli importanti
Mantieni freddo il tuo tampone GTE e rendilo in piccole quantità per impedire la crescita di batteri indesiderati in esso. Lo zucchero e il pH controllato rappresentano un ottimo mezzo di crescita. Utilizzare sempre acqua purificata. L'acqua del rubinetto può avere un eccesso di ioni metallici dai tubi, che può sopraffare la capacità dell'EDTA di catturare. Se sospetti la presenza di RNA interferente nel tuo campione, aggiungi RNase A a 100 microgrammi per millilitro al tuo buffer GTE per eliminare il problema.
