Un nuovo metodo per migliorare l'alto rendimento, purezza elevata, la purificazione ad alta attività di proteine ​​complesse da 10 a 500 volte è stata sviluppata presso l'Università dell'Alabama a Birmingham.

"Questo nuovo metodo offre una serie di vantaggi cruciali sia ai ricercatori che all'industria farmaceutica, " ha detto Dmitry Vassylyev, professore di biochimica e genetica molecolare alla UAB. "È potenzialmente lo strumento più efficiente e universale per studi ad alto rendimento di molti sistemi biologici significativi e può aiutare la produzione su larga scala di proteine ​​terapeutiche".

Ad alto rendimento, purezza elevata, purificazione ad alta attività, o HHH, è il Santo Graal per le applicazioni strutturali e industriali. Lo schema di purificazione a fase singola UAB supera i punti deboli significativi degli attuali sistemi di purificazione disponibili in commercio, dice Vassiliev.

In un articolo pubblicato su Atti dell'Accademia Nazionale delle Scienze , Vassylyev e i colleghi di UAB hanno testato il loro metodo di purificazione della cromatografia di affinità CL7/Im7 su cinque molecole biologiche tradizionalmente impegnative, comprese le proteine ​​di membrana procariotiche ed eucariotiche e le proteine ​​leganti DNA/RNA multisubunità.

"Una notevole illustrazione delle prestazioni superiori dell'approccio CL7/Im7, " hanno scritto nel rapporto PNAS, "è che il campione di proteine ​​CNX, che abbiamo purificato in poche ore e da pochi grammi di cellule di E. coli, avrebbe un valore di mercato di circa $ 400, 000, secondo i prezzi commerciali correnti."

Il sistema è semplice e riutilizzabile:i ricercatori UAB hanno ripristinato e riutilizzato la loro colonna per cromatografia di affinità più di 100 volte, mantenendo una capacità di legame di quasi il 100%.

Il metodo si basa sull'affinità di legame straordinariamente forte tra le tossine batteriche chiamate colicine e le loro proteine ​​immunitarie specifiche. Un batterio ospite può rilasciare una tossina della colicina, come la Colicin E7 DNAse, che è in grado di uccidere altri batteri. All'interno dei batteri ospiti, il CE7 è legato con Immunity Protein 7, o Im7; questo legame impedisce la distruzione autoinflitta.

L'affinità di legame di CE7/Im7 è forte quasi quanto un legame covalente, ed è da quattro a sette ordini di grandezza superiore rispetto ad altri analoghi della cromatografia di affinità. Vassylyev e colleghi hanno realizzato una variante inattiva di CE7, chiamato CL7, che non ha attività DNasica ma mantiene la piena affinità di legame per Im7. Hanno anche realizzato una variante di Im7 che consente un accoppiamento efficiente con perline di agarosio.

Utilizzando tecniche genetiche, il tag CL7 è facilmente inserito nei geni delle proteine ​​bersaglio, sia negli eucarioti che nei procarioti. Questi geni possono essere spostati su un vettore di espressione, oppure la proteina bersaglio marcata può essere espressa da cellule native senza amplificazione.

Quando un lisato proteico grezzo viene versato attraverso una colonna riempita con le sfere di agarosio Im7, i tag CL7 sulla proteina bersaglio si legano all'Im7. Un sito di proteasi ingegnerizzato viene utilizzato per rilasciare la proteina bersaglio dal tag CL7 legato. Ciò consente la purificazione HHH in un unico passaggio, con una purezza dal 97 al 100%, per le proteine ​​bersaglio testate dai ricercatori UAB.

In contrasto, gli schemi di purificazione più pubblicati per queste proteine ​​impegnative sono multistep, protocolli plurigiornalieri, con rese inferiori. Vassylyev, un cristallografo di proteine, dice che ottenere grandi quantità di proteine ​​pure è il passo limitante in cristallografia, spingendolo a iniziare la ricerca di un metodo migliore quattro anni fa.

Le proteine ​​impegnative purificate nel rapporto PNAS erano batteriche Thermus thermophilus RNA polimerasi e Mycobacteria tuberculosis RNA polimerasi, che sono proteine ​​multisubunità; YidC membrana integrasi, una proteina di membrana di Bacillus halodurans; calnexina, o CNX, una proteina chaperone transmembrana umana; e due proteine ​​che legano gli acidi nucleici, il complesso proteico di condensazione multisubunità di Salmonella typhimurium che piega e compatta il DNA cellulare, e il complesso del fattore di rimodellamento e spaziatura umana, RSF, che è implicato nella mediazione dell'assemblaggio del nucleosoma.

Il semplice sistema di purificazione è applicabile anche agli esperimenti pulldown e all'attività cinetica o ai saggi di legame, come la risonanza plasmonica di superficie. Può anche aiutare la microscopia crioelettronica.