Una tecnica di imaging a singola molecola, chiamato miglioramento della fluorescenza indotta da proteine ​​(PIFE), ha guadagnato terreno negli ultimi anni come strumento popolare per osservare le interazioni DNA-proteina con precisione nanometrica. Ancora, secondo un nuovo studio KAUST, i laboratori di ricerca non hanno utilizzato la tecnica al massimo delle sue potenzialità.

Il saggio PIFE si basa sull'idea che il DNA etichettato con un colorante fluorescente risplenderà più luminoso quando le proteine ​​si legheranno nelle vicinanze. In molti casi, questo è vero, il che ha portato molti scienziati ad adottare il PIFE rispetto ad altre tecniche più laboriose che si basano sulla doppia etichettatura di proteine ​​e DNA.

Ma gli studenti laureati di Samir Hamdan, Fahad Rashid, Manal Zaher e Vlad-Stefan Raducanu si sono resi conto che il legame delle proteine ​​ai complessi DNA-colorante a volte poteva avere anche l'effetto opposto. Invece di aumentare il segnale fluorescente, le interazioni proteiche a volte possono smorzare il bagliore, a seconda di determinate proprietà del sistema.

Hamdan attribuisce la curiosità dei suoi studenti per fare questa osservazione e dettagliare come funziona. L'ispirazione dal lavoro precedente di Rashid ha portato il team al fenomeno chiamato estinzione della fluorescenza indotta da proteine ​​(PIFQ). E come spiega Rashid, "Abbiamo deciso di definire meglio le condizioni che portano a boom o busti fluorescenti".

Attraverso una combinazione di analisi sperimentali e computazionali, il team KAUST ha dimostrato che lo stato iniziale di fluorescenza del complesso DNA-colorante determina se il PIFE o il PIFQ risulterà dopo il legame con le proteine. Senza questa conoscenza, la probabilità di entrambi gli eventi diventa equivalente al lancio di una moneta, che possono compromettere l'interpretazione meccanicistica dei risultati di laboratorio.

"Quando la comprensione di questo stato iniziale viene raccolta dalla fluorescenza e dal lavoro strutturale, l'anticipazione di entrambi gli effetti diventa sperimentalmente fattibile, " spiega Raducanu.

Fattori come la sequenza del DNA e la posizione del colorante potrebbero far pendere l'equilibrio verso PIFE o PIFQ; il team KAUST è diventato così bravo nell'interpretazione del codice molecolare che è stato in grado di prevedere con precisione cosa sarebbe successo semplicemente misurando come questi parametri influenzano lo stato iniziale di fluorescenza del sistema colorante DNA.

"Abbiamo trasformato ogni misura in un gioco, "Zaher dice, "e siamo felici di dire che la nostra ipotesi ha previsto il risultato più del 90% delle volte!"

Queste nuove intuizioni dovrebbero espandere notevolmente la portata e la promessa sperimentale di questo potente strumento di imaging a singola molecola, predice Raducanu. "Introducendo PIFQ, offriamo ai ricercatori nel campo la possibilità di affrontare diverse questioni biologiche in cui il PIFE potrebbe non essere stato visto, " lui dice.

Gli scienziati possono anche scegliere di combinare PIFE e PIFQ per decifrare processi multistep e multiprotein con un solo costrutto DNA-dye.

"Prendere in considerazione la natura dipendente dal contesto della modulazione della fluorescenza nel sistema colorante del DNA apre le porte a molte possibilità nella progettazione sperimentale che potrebbero essere adattate alle esigenze dei ricercatori, " dice Zaher.

"Ora anticipiamo che l'interpretazione dei dati e l'attribuzione di eventi molecolari da dati di singole molecole diventeranno più facili e precisi, " aggiunge Rashid.