I ricercatori del Centro brasiliano per la ricerca sull'energia e sui materiali (CNPEM) hanno ingegnerizzato geneticamente un fungo per produrre un cocktail di enzimi che scompongono i carboidrati nella biomassa, come spazzatura di canna da zucchero (cime e foglie) e bagassa, in zucchero fermentescibile per una conversione industrialmente efficiente in biocarburante.

Lo sviluppo di cocktail enzimatici a basso costo è una delle principali sfide nella produzione di etanolo di seconda generazione.

I biocarburanti di seconda generazione sono prodotti da vari tipi di biomassa non alimentare, compresi i residui agricoli, trucioli di legno e olio da cucina esausto. Il processo del gruppo di ricerca CNPEM apre la strada a un uso ottimizzato dei residui di canna da zucchero per la produzione di biocarburanti.

Il fungo Trichoderma reesei è uno dei più prolifici produttori di enzimi che degradano la parete cellulare delle piante ed è ampiamente utilizzato nell'industria biotecnologica. Per migliorare la sua produttività come biofabbrica per il cocktail enzimatico in questione, i ricercatori hanno introdotto sei modifiche genetiche in RUT-C30, un ceppo pubblicamente disponibile del fungo. Hanno brevettato il processo e lo hanno riportato in un articolo pubblicato sulla rivista Biotecnologie per i biocarburanti .

"Il fungo è stato modificato razionalmente per massimizzare la produzione di questi enzimi di interesse biotecnologico. Utilizzando la tecnica di modifica del gene CRISPR/Cas9, abbiamo modificato i fattori di trascrizione per regolare l'espressione dei geni associati agli enzimi, proteasi cancellate che hanno causato problemi con la stabilità del cocktail enzimatico, e ha aggiunto importanti enzimi che il fungo manca in natura. Di conseguenza, siamo stati in grado di consentire al fungo di produrre una grande quantità di enzimi dai rifiuti agroindustriali, una materia prima economica e abbondante in Brasile, "Mario T. Murakami, Direttore Scientifico del Laboratorio Biorinnovabili del CNPEM (LNBR), ha detto ad Agência FAPESP.

Circa 633 milioni di tonnellate di canna vengono lavorate per raccolto in Brasile, generando annualmente 70 milioni di tonnellate di rifiuti di canna (massa secca), secondo la National Food Supply Company (CONAB). Questi rifiuti sono sottoutilizzati per la produzione di etanolo combustibile.

Murakami ha sottolineato che praticamente tutti gli enzimi utilizzati in Brasile per decomporre la biomassa sono importati da alcuni produttori stranieri che mantengono la tecnologia sotto protezione del segreto commerciale. In tale contesto, il cocktail di enzimi importato può rappresentare fino al 50% del costo di produzione di un biocarburante.

"Secondo il paradigma tradizionale, sono stati necessari decenni di studi per sviluppare una piattaforma di produzione di cocktail enzimatici competitiva, " ha detto. "Inoltre, i cocktail non potevano essere ottenuti esclusivamente con tecniche di biologia sintetica da ceppi pubblicamente disponibili perché i produttori usavano metodi diversi per svilupparli, come l'evoluzione adattativa, esponendo il fungo a reagenti chimici, e indurre mutazioni genomiche al fine di selezionare il fenotipo più interessante. Ora, però, grazie a strumenti avanzati di editing genetico come CRISPR/Cas9, siamo riusciti a creare una piattaforma competitiva con poche modifiche razionali in due anni e mezzo."

Il bioprocesso messo a punto dai ricercatori del CNPEM ha prodotto 80 grammi di enzimi per litro, il titolo più alto supportato sperimentalmente finora riportato per T. reesei da una materia prima a base di zucchero a basso costo. Questa è più del doppio della concentrazione precedentemente riportata nella letteratura scientifica per il fungo (37 grammi per litro).

"Un aspetto interessante di questa ricerca è che non era confinata al laboratorio, " ha detto Murakami. "Abbiamo testato il bioprocesso in un ambiente di produzione semi-industriale, ampliandolo per un impianto pilota per valutarne la fattibilità economica".

Sebbene la piattaforma sia stata personalizzata per la produzione di etanolo cellulosico da residui di canna da zucchero, Ha aggiunto, può abbattere altri tipi di biomassa, e gli zuccheri avanzati possono essere utilizzati per produrre altri biorinnovabili come plastica e prodotti chimici intermedi.

Nuova classe di enzimi

Il processo è stato il risultato pratico (in termini di applicazione industriale) di un'ampia ricerca condotta da LNBR per sviluppare enzimi in grado di scomporre i carboidrati. In un altro studio supportato da FAPESP e pubblicato su Natura chimica biologia , i ricercatori hanno rivelato sette nuove classi di enzimi presenti soprattutto nei funghi e nei batteri.

I nuovi enzimi appartengono alla famiglia dei glicosidi idrolasi (GH). Secondo Murakami, questi enzimi hanno un potenziale significativo per applicazioni non solo nel campo dei biocarburanti ma anche in medicina, industria alimentare e tessile, Per esempio. Gli enzimi ispireranno nuovi processi industriali sfruttando i diversi modi in cui la natura decompone i polisaccaridi (carboidrati costituiti da molti zuccheri semplici).

Questi enzimi scompongono i beta-glucani, alcuni dei polisaccaridi più abbondanti presenti nelle pareti cellulari dei cereali, batteri e funghi, e una grande frazione della biomassa disponibile nel mondo, indicando il potenziale uso degli enzimi nei conservanti alimentari e nei tessili. Nel caso dei biocarburanti, la proprietà chiave è la loro capacità di digerire materiale ricco di fibre vegetali.

"Abbiamo deciso di studiare la diversità della natura nei polisaccaridi degradanti e come questa conoscenza può essere applicata ai processi in diversi settori, " ha detto Murakami. "Oltre alla scoperta di nuovi enzimi, un altro aspetto importante di questa ricerca è l'approccio della rete di similarità che utilizziamo per produrre una conoscenza sistematica e profonda di questa famiglia di enzimi. L'approccio ci ha permesso di partire da zero e in un tempo relativamente breve, arrivare alla famiglia più studiata di enzimi attivi su beta-1, 3-glucani fino ad oggi, con informazioni disponibili sulla specificità e sui meccanismi di azione."

Il criterio principale per la classificazione degli enzimi è solitamente la filogenesi, cioè., la storia evolutiva della molecola, mentre i ricercatori del CNPEM si concentrano sulla funzionalità.

"Grazie ai progressi nella tecnologia di sequenziamento del DNA, ora abbiamo molte sequenze genetiche conosciute e una consolidata capacità di studiare e caratterizzare molecole ed enzimi in termini di funzionalità. Di conseguenza, siamo stati in grado di affinare la metodologia della rete di similarità e usarla per la prima volta per studiare enzimi attivi sui polisaccaridi, " ha detto Murakami.

Utilizzando l'approccio della rete di similarità, il gruppo ha classificato sette sottofamiglie di enzimi in base alla funzionalità. Caratterizzando almeno un membro di ciascuna sottofamiglia, i ricercatori hanno avuto accesso in termini sistematici alla diversità delle strategie molecolari per degradare i beta-glucani contenuti in migliaia di membri della famiglia degli enzimi.

Tour de force biochimico

L'analisi filogenetica si concentra sulle regioni del DNA che sono state conservate nel tempo, mentre la classificazione per funzionalità si basa su regioni non conservate associate alla differenziazione funzionale. "Questo ci ha dato efficienza e ci ha permesso di raggruppare più di 1, 000 sequenze in soli sette sottogruppi o classi con la stessa funzione, " ha detto Murakami.

Poiché l'approccio era nuovo, i ricercatori hanno eseguito diversi altri studi per ricontrollare e convalidare il metodo di classificazione. Dei sette gruppi di enzimi in grado di degradare i polisaccaridi, hanno ottenuto 24 strutture completamente nuove, compresi vari complessi substrato-enzima, considerato cruciale nel fornire informazioni per aiutare a comprendere i meccanismi di azione coinvolti.

Lo studio comprendeva analisi funzionali e strutturali per capire come questi enzimi agiscono sui carboidrati interessati. "I polisaccaridi sono disponibili in dozzine di configurazioni e sono capaci di molti tipi di legami chimici, "Ha detto Murakami. "Volevamo osservare esattamente quali legami chimici e architetture sono riconosciuti da ciascun enzima. Per questa ragione, doveva essere uno studio multidisciplinare, combinando dati strutturali e funzionali supportati da analisi mediante spettrometria di massa, spettroscopia, esperimenti di mutagenesi e diffrazione per chiarire la struttura atomica".

Nella sezione "Notizie e visualizzazioni" dello stesso numero di Natura chimica biologia , Professor Paul Walton, Cattedra di Chimica Bioinorganica presso l'Università di York nel Regno Unito, ha valutato lo studio sulla glicoside idrolasi un "tour de force" biochimico per il suo approccio innovativo e ha elogiato le sue "tremende intuizioni", aggiungendo che i ricercatori sono stati "in grado di esprimere e isolare esemplari da ciascuna classe [di enzimi] per esaminare se le differenze nelle sequenze tra le classi si riflettessero nelle loro strutture e attività".