I metaboliti microbici secondari, quelle molecole non essenziali per la crescita ma essenziali per la sopravvivenza, potrebbero ora essere più facili da caratterizzare in seguito a uno studio proof-of-concept in cui i ricercatori hanno accoppiato le tecnologie CRISPR e CRAGE.

Sebbene CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sia lo strumento principale per l'editing accurato dei genomi, la sua efficacia è stata storicamente limitata a causa della mancanza di strumenti robusti disponibili per trasportare CRISPR nei microrganismi. CRAGE (Chassis-independent Recombinase-Assisted Genome Engineering) è una tecnica che i ricercatori possono utilizzare per integrare grandi carichi genetici direttamente in diversi microbi.

La combinazione di CRAGE con CRISPR fornisce ai ricercatori una potente aggiunta al loro kit di strumenti per studiare la funzione dei geni. A titolo dimostrativo, i ricercatori hanno utilizzato CRAGE-CRISPR per scoprire metaboliti secondari attivi e aiutarli a identificare e descrivere le funzioni dei cluster di geni biosintetici che li producono.

I metaboliti secondari sono composti microbici prodotti in risposta a difficoltà o competizione. Costituiscono la base per una serie di prodotti vitali in biotecnologia, medicina, agricoltura e altri settori, ma c'è ancora così tanto su di loro che non sappiamo.

Sbloccare il potere dei metaboliti secondari può essere complicato perché i BGC che li producono non possono essere attivati ​​in ambienti di laboratorio. CRAGE ha fatto qualche progresso nel superare questo ostacolo quando è apparso sulla scena nel 2019. Ora, quel potere è pronto a crescere in modo esponenziale combinandolo con CRISPR.

Impiegando CRAGE, i ricercatori non si limitano più a utilizzare i microbi host modello; teoricamente, qualsiasi microbo può fungere da fabbrica per la produzione di composti chimici di interesse. Utilizzando CRAGE per addomesticare i microbi bersaglio, gli utenti di JGI possono quindi utilizzare CRISPR in una varietà di ospiti microbici.

Photorhabdus luminescens si rivela fatale per gli insetti. È trasportato da un nematode infettivo e rilascia tossine nel flusso sanguigno dell'insetto che uccidono rapidamente l'ospite. Comprendere esattamente come funzionano P. luminescens e i suoi metaboliti secondari potrebbe fornire nuovi strumenti per il controllo dei parassiti.

I metaboliti secondari sono altamente regolati nei batteri, rendendo difficile identificare quale via corrisponda a quale metabolita. Trovare un veicolo attraverso il quale introdurre CRISPR nel microbo è fondamentale, perché consente ai ricercatori di eliminare o attivare determinati geni e valutare in che modo queste modifiche influiscono sulla funzionalità.

CRAGE consente il trapianto di questi BGC da un organismo a un ospite alternativo tramite una piattaforma di atterraggio che consiste in un gene della cre ricombinasi e siti lox che si escludono a vicenda. In definitiva, questo processo consente ai ricercatori di identificare ceppi in grado di produrre metaboliti secondari all'interno di un ambiente di laboratorio, illuminando questa "materia oscura biologica".

Offre inoltre a CRISPR un punto di ingresso. Utilizzando CRISPR per eliminare o attivare i geni, i ricercatori del JGI sono stati in grado di monitorare la perdita e il guadagno di funzione. I dati analitici dello studio mostrano picchi e valli nei metaboliti secondari man mano che i geni vengono modificati. Con l'aiuto di CRAGE, l'accoppiamento ha dimostrato di confermare rapidamente una maggiore produzione di 22 metaboliti da sei cluster di geni biosintetici. Uno di questi era un metabolita da un cluster di geni biosintetici precedentemente non caratterizzato. Quel lavoro dei ricercatori JGI è stato pubblicato nell'aprile 2022 in Cell Chemical Biology .

Quando si tratta in particolare dell'assassino di insetti P. luminescens, la comprensione dei suoi metaboliti secondari e dei loro percorsi potrebbe alimentare ulteriori applicazioni agricole per il controllo dei parassiti e capire come l'agente patogeno utilizza gli insetti come carburante.

L'impatto della coppia potrebbe rivelarsi molto più ampio. La compatibilità di CRAGE e CRISPR potrebbe potenzialmente consentire l'introduzione di CRISPR in altri batteri, migliorando così la comprensione da parte della comunità scientifica di come vengono prodotti i metaboliti secondari e di come sfruttarne i poteri in agricoltura, prodotti farmaceutici, biocarburanti e oltre. + Esplora ulteriormente

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