Figura 1:Il percorso di biosintesi della betaxantina e composti utili che possono essere sintetizzati dalla tirosina. Credito:Università di Kobe
I ricercatori della Kobe University hanno sviluppato con successo uno chassis di tirosina (un ceppo di microrganismo con un'elevata produttività di tirosina) nel lievito Pichia pastoris attraverso un'ingegneria razionale. Inoltre, hanno utilizzato questo telaio in tirosina per sviluppare cellule intelligenti in grado di produrre rispettivamente i composti di origine vegetale resveratrolo, naringenina, norcoclaurina e reticolina. Questi composti hanno una vasta gamma di applicazioni; ad esempio vengono utilizzati per aggiungere nutrimento agli alimenti e come materia prima per i medicinali. Si spera che questo telaio in tirosina possa essere utilizzato come punto di partenza per la biosintesi ad alto rendimento di vari composti utili e prodotti chimici generici.
Questo studio dell'Università di Kobe è stato condotto da un gruppo di ricerca che includeva il dottorato di ricerca. studente Kumokita Ryota (Scuola di specializzazione in scienze, tecnologia e innovazione) e il professor Hasunuma Tomohisa (Centro di ricerca sulla biologia ingegneristica).
Questi risultati della ricerca sono stati pubblicati sulla rivista scientifica internazionale ACS Synthetic Biology il 16 maggio 2022.
Dalla tirosina vengono prodotti composti aromatici di origine vegetale bioattivi come stilbenoidi, flavonoidi e alcaloidi benzilisochinolinici (BIA). Questi composti hanno una vasta gamma di applicazioni in molti settori, tra cui la produzione chimica, l'industria alimentare, cosmetica e farmaceutica. Questi composti aromatici sono attualmente prodotti per estrazione diretta dalle piante, tuttavia all'interno delle piante si trovano solo piccole quantità e la resa dipende molto dal clima e dal clima. Non c'è una fornitura stabile.
Negli ultimi anni, i progressi della biologia sintetica hanno portato allo sviluppo di tecniche per produrre composti utili. Queste tecniche sfruttano la capacità dei microrganismi di produrre sostanze introducendo vie metaboliche di origine vegetale nel microrganismo in modo che produca il composto bersaglio. Tra i microrganismi, i lieviti hanno ricevuto attenzione come ospiti per la produzione di composti perché eccellono nella biosintesi di composti di origine vegetale. Tuttavia, il potenziale dei lieviti per la produzione di composti derivati dalla tirosina non era chiaro poiché erano stati segnalati pochi successi.
Figura 2:utilizzo della betaxantina per rilevare i geni correlati all'aumento della produttività della tirosina. Credito:Università di Kobe
In questo studio, i ricercatori hanno iniziato creando un ceppo di lievito in grado di produrre elevate rese di tirosina. Utilizzando questo nuovo ceppo come punto di partenza, hanno modificato il suo metabolismo per raggiungere il suddetto obiettivo di produrre rese elevate di vari composti utili. Il tipo di lievito su cui si sono concentrati era P. pastoris. P. pastoris si moltiplica rapidamente in condizioni aerobiche e non produce sottoprodotti fermentativi (etanolo), il che significa che ha il potenziale per produrre rese elevate di un composto bersaglio in un breve lasso di tempo. Tuttavia, nessuno studio aveva riportato la produzione di composti derivati dalla tirosina in P. pastoris e non era noto quali geni sarebbero stati utili per produrre rese elevate. Mentre conducevano una semplice valutazione sulla quantità di tirosina prodotta, i ricercatori hanno anche cercato geni che migliorassero la produzione di tirosina. Hanno quindi valutato il potenziale di P. pastoris per la biosintesi di composti utili derivati dalla tirosina introducendo percorsi di biosintesi nel lievito per ciascuno dei seguenti elementi:lo stilbenoide resveratrolo, il flavonoide naringenina e le BIA norcoclaurina e reticolina.
Prima di tutto, i ricercatori hanno cercato di trovare geni nei ceppi di lievito che aumentano la produzione di tirosina. Per fare ciò, si sono concentrati sulla betaxantina, che può essere prodotta dalla tirosina in una reazione in 3 fasi (Figura 1).
La betaxantina è un pigmento giallo che emette una fluorescenza verde. Pertanto, è facile valutare la forza del flusso metabolico alla tirosina osservando l'intensità e il colore della fluorescenza. Nel creare questo metodo di valutazione, i ricercatori hanno scoperto geni che hanno migliorato la produttività della tirosina e hanno utilizzato questa conoscenza per sviluppare con successo un ceppo di P. pastoris con un'elevata produttività della tirosina (Figura 2).
Figura 3:Risultati dell'esperimento di cultura Pichia pastoris. Credito:Università di Kobe
Figura 4:Risultati dell'analisi dei metaboliti intracellulari nel lievito Pichia pastoris. Credito:Università di Kobe
Figura 5:Glicerolo utilizzato come materia prima per la produzione microbica. Credito:Università di Kobe
Il prossimo obiettivo dei ricercatori era migliorare la velocità di produzione di vari composti utili derivati dalla tirosina modificando il metabolismo del ceppo ad alta produttività. Sono riusciti a migliorare notevolmente la produzione di resveratrolo, naringenina e norcoclaurina introducendo percorsi di biosintesi specifici (Figura 1) per ciascuno, rivelando che P. pastoris può produrre elevate rese di composti derivati dalla tirosina (Figura 3).
Successivamente, il gruppo di ricerca ha analizzato in modo completo i metaboliti intracellulari nel nuovo ceppo di P. pastoris che hanno sviluppato e studiato il meccanismo per un'elevata produttività della tirosina. I risultati hanno rivelato che un gran numero di metaboliti della via shikimate coinvolti nella sintesi di tirosina e tirosina si accumulavano nel ceppo ingegnerizzato (Figura 4). Questi risultati mostrano che la modifica del metabolismo ha migliorato con successo il flusso metabolico alla tirosina. Esiste un potenziale futuro per aumentare ulteriormente la produzione di composti utili che possono essere biosintetizzati dalla tirosina ottimizzando il metabolismo della via dello shikimato.
Infine, i ricercatori miravano a produrre composti derivati dalla tirosina tramite fermentazione con glicerolo grezzo come mezzo di crescita. Il glicerolo grezzo è un importante sottoprodotto di scarto della produzione di carburante biodiesel (una potenziale alternativa al carburante petrolchimico). Il gruppo di ricerca ha utilizzato il liquido (Figura 5, a destra) ottenuto dalla neutralizzazione del glicerolo grezzo come mezzo di crescita in un esperimento di produzione microbica. In questo esperimento, sono riusciti a produrre le stesse quantità di resveratrolo, naringenina e norcoclaurina di quando è stato utilizzato il glicerolo puro. Questi risultati mostrano che P. pastoris può produrre composti utili non solo dal glicerolo puro, ma anche dal glicerolo grezzo.
Il telaio della tirosina sviluppato attraverso questa ricerca può essere applicato alla produzione fermentativa di vari composti utili e sostanze chimiche generiche che possono essere biosintetizzate dalla tirosina. Inoltre, i ricercatori sperano di aumentare ulteriormente la produzione di composti derivati dalla tirosina utilizzando i risultati dell'analisi del metaboloma del loro nuovo ceppo di P. pastoris come base per l'ottimizzazione del percorso metabolico. + Esplora ulteriormente
