Questo protocollo delinea un metodo comune per misurare l'attività del nitrato reduttasi mediante nitrito di sodio come standard.
Materiali:
* Materiale vegetale: Foglie fresche, radici o altri tessuti contenenti nitrati reduttasi.
* Buffer di estrazione:
* Tampone Tris-HCl da 100 mm, pH 7,5
* 1 mm EDTA
* 10 mm DTT (dithiothreitol)
* 0,1% (p/v) albumina sierica bovina (BSA)
* miscela di reazione:
* Tampone fosfato di potassio da 100 mm, pH 7,5
* 10 mm di nitrato di sodio
* 1 mm NADH
* Soluzione standard di nitrito di sodio: Preparare una soluzione standard di concentrazione nota (ad es. 100 ppm).
* Reagente griess: (Fare riferimento a istruzioni specifiche del protocollo)
* Spettrofotometro: Per misurare l'assorbanza a 540 nm.
* Centrifuga: Per separare i detriti cellulari.
* Bath Ice: Per mantenere le temperature fredde.
* Pipette e suggerimenti: Per misurazioni del volume accurate.
Procedura:
1. Preparazione del campione:
* Raccogli il materiale vegetale e sciacquare rapidamente con acqua distillata fredda.
* Pesare una quantità adeguata di tessuto (ad es. 0,1-1 g) e macinarlo in un mortaio e un pestello con azoto liquido o usando un omogeneizzatore nel tampone di estrazione.
* Centrifuga l'omogenato a 10.000 g per 10 minuti a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. Il surnatante è il tuo estratto enzimatico.
2. Nitrato reduttasi Assay:
* Preparare una serie di tubi contenenti la miscela di reazione, inclusi spazi vuoti senza estratto di enzimi e tubi con concentrazioni variabili di standard di nitrito di sodio.
* Aggiungi un volume appropriato di estratto enzimatico ai tubi di reazione.
* Avvia la reazione aggiungendo NADH.
* Incubare i tubi a 30 ° C per un tempo specifico (ad es. 30 minuti).
* Termina la reazione aggiungendo il reagente Griess.
3. Misurazione della produzione di nitriti:
* Incubare i tubi al buio per almeno 15 minuti per consentire lo sviluppo del colore.
* Misurare l'assorbanza a 540 nm usando uno spettrofotometro.
* Preparare una curva standard usando le concentrazioni note di nitrito di sodio.
* Calcola la quantità di nitrito prodotto dall'estratto enzimatico usando la curva standard.
4. Calcolo dell'attività di nitrato reduttasi:
* Esprimi l'attività della nitrata reduttasi come µmoles di nitrito prodotto per minuto per grammo di peso fresco (FW) o proteina .
Nota:
* Questo protocollo è uno schema di base e possono essere necessarie modifiche specifiche a seconda delle specie vegetali e della configurazione sperimentale.
* Assicurarsi che tutte le soluzioni siano preparate fresche e conservate in modo appropriato.
* Utilizzare reagenti di alta qualità per risultati accurati.
* Controllo per l'assorbanza di fondo misurando l'assorbanza degli spazi vuoti senza estratto di enzimi.
* Ripeti il test almeno tre volte per garantire la riproducibilità.
Reagente griess:
* Il reagente Griess viene utilizzato per rilevare il nitrito reagendo con esso per produrre una tintura Azo di colore viola.
* È possibile utilizzare diversi reagenti griess, quindi fare riferimento al protocollo specifico per la preparazione e l'utilizzo.
Metodi alternativi:
* Altri metodi per misurare l'attività del nitrato reduttasi includono l'uso di nitrato come substrato e rilevare la riduzione del nitrato in nitrito.
* Misurazione spettrofotometrica Può essere impiegato per misurare direttamente la variazione della concentrazione di NADH nel tempo.
Interpretazione:
L'attività di nitrati reduttasi è un indicatore della capacità della pianta di ridurre il nitrato al nitrito, che è un passo cruciale nell'assimilazione dell'azoto. Confrontare l'attività in diversi tessuti o in condizioni diverse può rivelare informazioni preziose sul metabolismo dell'azoto della pianta.
Ulteriori informazioni:
* Modifiche del protocollo per specie o condizioni di piante specifiche: Fare riferimento alla letteratura scientifica pertinente o agli esperti di contatto per la guida.
* Risoluzione dei problemi: Consultare le guide di risoluzione dei problemi o consultare esperti in caso di problemi con il dosaggio.
Questo protocollo fornisce un quadro generale per la misurazione dell'attività di nitrato reduttasi mediante nitrito di sodio come standard. Adattalo alle tue esigenze specifiche e assicurati risultati accurati.
