Rappresentazione schematica del sistema di microscopia ibrida contenente un sottosistema per microscopia optoacustica a doppia lunghezza d'onda a 488 nm e 808 nm, co-allineato con un sottosistema per microscopia multifotonica a 1043 nm. a) amplificatore AMP, Telecamera CCD a campo chiaro, Scheda di acquisizione dati DAQ, Specchio dicroico DM, Controller per specchio galvanometrico GC, IQD IQ demodulatore, LO1 oscillatore locale 1, LO2 oscillatore locale 2, Filtri NDF a densità neutra, OA optoacustica, DI filtro ottico, personal computer, PH foro stenopeico, tubo fotomoltiplicatore PMT, SHG seconda generazione armonica, THG terza generazione armonica, Fluorescenza di eccitazione a due fotoni TPEF, stadi motorizzati xyz. b) Lo spettro delle lunghezze d'onda di eccitazione e rivelazione nell'imaging ibrido FDOM/multifotone (MP). c) Confronto schematico tra microscopia optoacustica nel dominio del tempo (TD), che utilizza brevi impulsi di luce, e microscopia optoacustica nel dominio della frequenza (FD), che si basa sull'intensità del laser modulata a più frequenze discrete. Credito: Luce:scienza e applicazioni . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
L'imaging optoacustico alimentato da brevi raffiche di laser a onda continua (CW) può stimolare l'emissione di onde ultrasoniche all'interno di un animale o in soggetti umani. Il metodo può catturare in modo non invasivo il flusso sanguigno e produrre immagini 3D della microarchitettura cellulare. Scrivendo in Luce:scienza e applicazioni , Stephan Kellnberger e colleghi dell'Istituto di imaging biologico e medico, ora segnalano la possibilità di ottenere immagini optoacustiche ad alta fedeltà con laser economici controllati a più frequenze.
Gli autori hanno dimostrato sperimentalmente il multiplo basato sulla frequenza, generazione di immagini ad alta fedeltà dell'architettura biologica mediante l'imaging della microvascolarizzazione dei tessuti di pesci e topi. Negli esperimenti di imaging, sovrapponevano dettagli strutturali che apparivano solo a specifiche frequenze di interesse. Gli autori hanno anche identificato in modo non invasivo la velocità del flusso sanguigno nel microcircolo tissutale monitorando gli spostamenti di frequenza utilizzando l'effetto Doppler optoacustico.
Il rilevamento optoacustico (fotoacustico) di solito richiede tecnologie laser complesse. Tali tecniche possono generare lunghezze di nanosecondi (1-100 ns), impulsi fotonici brevi ad alta energia che illuminano convenzionalmente energia transitoria (di breve durata) nel dominio del tempo (TD). Gli impulsi ultracorti possono stimolare l'emissione di onde ultrasoniche a banda larga, raccolti nell'intervallo dei microsecondi per formare immagini optoacustiche. Però, la complessa tecnologia laser può imporre una frequenza di ripetizione degli impulsi (PRF) bassa e limitare il numero di lunghezze d'onda simultaneamente disponibili per l'imaging spettrale. Per evitare tali limiti, Kellnberger et al. ha sviluppato la microscopia optoacustica nel dominio della frequenza (FDOM), in cui l'intensità della luce può essere controllata o modulata a più frequenze discrete utilizzando hardware conveniente.
Spiegazione della codifica di frequenza in FDOM a doppia lunghezza d'onda. a) Schema semplificato di codifica in frequenza su diverse lunghezze d'onda. La sorgente laser 1 che emette a λ1 =488 nm è stata caricata con la frequenza di modulazione più bassa f1, mentre la sorgente laser 2 che emette a λ2 =808 nm è stata caricata con la più alta frequenza di modulazione fend. Durante la creazione, abbiamo aumentato la modulazione della lunghezza d'onda λ1 e diminuito la frequenza di modulazione di λ2 in passi di fstep usando numeri dispari di frequenze di modulazione. b) Rappresentazione schematica di più frequenze di modulazione utilizzate per l'imaging, che mostra la sovrapposizione di frequenze a due lunghezze d'onda. Credito: Luce:scienza e applicazioni . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Finora, l'imaging optoacustico si è basato solo su tecniche che rilevano segnali nel dominio del tempo (TD) o su quelle che scansionano solo una singola frequenza a una o due lunghezze d'onda nel dominio della frequenza (FD). Il presente studio è stato il primo a condurre l'imaging optoacustico in vivo in un modello animale tramite illuminazione simultanea con due lunghezze d'onda.
Gli scienziati hanno combinato l'FDOM in un sistema ibrido per esaminare la relazione tra la formazione dell'immagine e il controllo della frequenza. L'uso di frequenze discrete (un massimo di nove), ha consentito misurazioni di spostamento Doppler optoacustiche non invasive come osservazioni di flusso in una camera di flusso microfluidica in laboratorio prima, e successivamente nel microcircolo tissutale in vivo. Nello studio, Kellnberger et al. utilizzato due laser a diodi CW che emettono luce a 488 nm e 808 nm per l'illuminazione.
Gli scienziati hanno implementato la FDOM, operando nella gamma di frequenza di 5-50 MHz, come sistema ibrido con microscopia multifotone (MP) operante a 1043 nm. Hanno quindi eseguito l'imaging bi/tridimensionale basato sull'ampiezza degli ultrasuoni e misurazioni di fase a frequenze multiple. L'ampiezza e la fase dei segnali optoacustici generati sono state risolte tramite demodulazione in tempo reale e registrate utilizzando un convertitore analogico-digitale. A causa degli alti tassi di ripetizione, il FDOM ha raggiunto elevati rapporti segnale-rumore (SNR), che porta alle immagini ad alta fedeltà osservate. In totale, lo studio ha esaminato la relazione tra la frequenza di modulazione, fedeltà dell'immagine e il rapporto segnale-rumore (SNR).
Imaging FDOM a lunghezza d'onda singola di una sutura e campioni di Zebrafish ex vivo. a) Un'illustrazione schematica della scansione di due suture incrociate. b) immagini FDOM con codice colore di due suture da 50 µm, basato su illuminazione a 488 nm e frequenze di modulazione di 10, 20, 30, e 40 MHz. La rappresentazione dello spazio di frequenza del colore (FSR) sovrappone i contributi di ciascuna frequenza di modulazione. L'immagine FSR in scala di grigi basata su quattro frequenze mostra l'immagine finale. c) Profilo in sezione trasversale della linea tratteggiata mostrata nel pannello b, che confronta i contrasti rivelati dalle varie frequenze di modulazione. d) Imaging ex vivo di un bulbo oculare di larva di zebrafish. L'immagine viola è stata ricostruita utilizzando basse frequenze (L) (10, 15, e 20 MHz); l'immagine verde utilizzando le frequenze medie (M) (25, 30, e 35 MHz); e l'immagine rossa usando le alte frequenze (H) (40, 45, e 50 MHz). La sovrapposizione con codice colore di tutte le frequenze (FSR, da 10 a 50 MHz) evidenzia il contributo di ciascuna regione spettrale. e) Il colore arancione rappresenta la somma dell'ampiezza per le nove frequenze di modulazione impiegate. f) Un'immagine in campo chiaro di un occhio di pesce zebra, convalidare la fedeltà delle immagini FDOM. g) Confronto dei rapporti segnale-rumore (SNR) di immagini di due suture incrociate (diametro 40 µm) ottenute mediante microscopia optoacustica FD e TD. L'immagine FDOM ha prodotto un SNR di ~35 dB. h) In contesti sperimentali simili, La microscopia TD ha prodotto un SNR di ~29 dB. Credito: Luce:scienza e applicazioni . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Per identificare le caratteristiche dell'imaging fotoacustico FD, gli scienziati hanno ripreso una coppia di suture incrociate in acqua a due lunghezze d'onda (488 nm e 808 nm) e frequenze di modulazione discrete. La sovrapposizione di vari contributi di frequenza portava informazioni sull'oggetto ripreso (suture).
Per estrarre informazioni da strutture più complesse, Kellnberger et al. fotografato ex vivo l'occhio di una lava di Zebrafish di tipo selvatico di 5 giorni, utilizzando nove frequenze di modulazione che vanno da 10-50 MHz a passi di 5 MHz. Gli scienziati hanno anche confrontato l'SNR (rapporto segnale-rumore) tra il metodo FDOM e il TD convenzionale, che variava in base a parametri sperimentali (energia laser, potenza impiegata e hardware di acquisizione dati).
I dati di ampiezza e fase multifrequenza potrebbero quindi essere elaborati per la ricostruzione di immagini 3D utilizzando una trasformata di Fourier basata sulla rappresentazione nello spazio della frequenza (FSR) e nella rappresentazione nello spazio del tempo (TSR). Rispetto alla TSR, la ricostruzione dell'immagine basata su FSR era computazionalmente più veloce e non richiedeva l'inversione dei dati durante la ricostruzione dell'immagine.
Imaging FDOM a lunghezza d'onda singola e doppia di un orecchio di topo in vivo. a) Imaging FDOM a 488 nm. Il colore ciano rappresenta l'immagine ricostruita, da nove frequenze equidistanti nell'intervallo da 10 a 50 MHz. b–d) Immagini singole ottenute a frequenze di modulazione di 10, 30, e 50 MHz, che raffigurano le strutture nel riquadro tratteggiato nel riquadro a. e) SNR in funzione di n frequenze utilizzate per la ricostruzione dell'FSR. Si osserva un miglioramento asintotico per n > 8 frequenze discrete. f) Una vista di profilo della casella tratteggiata nel riquadro a, che è delineato da una freccia tratteggiata bianca. Dimostra la relazione tra la frequenza di modulazione e la risoluzione dell'immagine. Le croci gialle evidenziano la risoluzione dell'immagine in funzione della frequenza di modulazione:una modulazione più veloce (50 MHz) può risolvere chiaramente piccole strutture, anche fino a 4 µm, mentre una modulazione più lenta (10 MHz) no. g–l) Imaging ibrido FDOM/multifotone di un orecchio di topo dopo l'iniezione di cellule di melanoma. g) Un'immagine di sovrapposizione ottenuta utilizzando quattro modalità di microscopia senza etichetta:FDOM a 488 nm e 808 nm, SHG a 522 nm, e THG a 348 nm. h) Un'immagine in campo chiaro che convalida i risultati ottenuti tramite microscopia ibrida; MC, cellule di melanoma. i) Imaging FDOM a 488 nm che mostra le cellule vascolari e di melanoma. j) Un'immagine FDOM a 808 nm che mostra cellule di melanoma B16F10 iniettate nell'orecchio del topo. k) Un'immagine SHG che mostra la distribuzione del collagene nell'epidermide. l) Un'immagine THG che mostri la morfologia del tessuto; prevalentemente cheratinociti e follicoli piliferi. Credito: Luce:scienza e applicazioni . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Per l'imaging tissutale in vivo basato su FDOM, gli scienziati hanno osservato l'orecchio di un topo anestetizzato. Hanno ottenuto immagini prive di artefatti con frequenze di modulazione multiple che corrispondevano alle frequenze spaziali dell'oggetto ripreso. Gli scienziati hanno utilizzato un massimo di nove frequenze nello studio. L'SNR dell'immagine è aumentato da ~14 dB a una singola frequenza a ~30 dB a nove frequenze per immagini più nitide.
Hanno quindi osservato un orecchio di topo contenente cellule di melanoma metastatico murino in vivo come prima tramite l'eccitazione sincronizzata di due lunghezze d'onda (488 nm e 808 nm) a frequenze di modulazione separate. Utilizzando la microscopia optoacustica e ottica combinata, Kellnberger e collaboratori sono stati in grado di visualizzare in modo efficiente le caratteristiche dei tessuti (ad es. cellule di melanoma, collagene e cheratinociti) senza tag o etichette fluorescenti convenzionali.
Kellnberger et al. ha quindi eseguito misurazioni FD micro-Doppler (µDoppler) con la configurazione per la prima volta in un orecchio di topo per l'imaging optoacustico del flusso sanguigno microcircolatorio in vivo. Prima di eseguire le misurazioni previste, gli scienziati hanno utilizzato particelle di carbonio nero a velocità di circolazione variabili in un chip microfluidico per convalidare la configurazione sperimentale. Il µDoppler FDOM è stato impiegato per generare successivamente una mappa della microcircolazione nell'orecchio di un topo. Il flusso sanguigno microcircolatorio ha rivelato una velocità gradualmente crescente dal bordo del vaso al nucleo.
Imaging optoacustico del flusso sanguigno microcircolatorio in un orecchio di topo in vivo. a Uno schema della configurazione del rilevamento µDoppler. FL1− flusso 1 lontano dal sensore US, FL2− flusso 2 lontano dal sensore US (FL2− < FL1−), FL1+ flusso 1 verso il sensore US, IN direzione del flusso nel chip, Chip microfluidico MC, Obiettivo OL, particelle di P, ecografia statunitense, Trasduttore ad ultrasuoni UT, frequenza di modulazione fmod, OUT direzione del flusso fuori dal chip. Le viste ravvicinate illustrano il rilevamento sperimentale di particelle che si allontanano dal sensore a ultrasuoni, che è equivalente a uno spostamento verso il rosso Doppler. b-d Spettri di frequenza media acquisiti a velocità di flusso di 0 mm·s−1 (verde), 0,3 mm·s-1 (rosso), o 1.3 mm·s−1 (rosso). Le ultime due velocità di flusso mostrano rispettivi spostamenti verso il rosso di 2 Hz e 7 Hz dalla frequenza di modulazione perché le particelle fluiscono lontano dal trasduttore. e Spostamenti Doppler misurati dalle particelle di carbonio in funzione della velocità del flusso in un chip microfluidico. La linea nera mostra un adattamento lineare ai dati. f Una proiezione di intensità massima di una regione di interesse (ROI) di dimensioni 160 × 160 µm² nell'orecchio del mouse, che mostra micro-vascolarizzazione. Barra della scala, 30µm. g Una mappa di flusso FDOM Doppler che è stata registrata nella stessa ROI, che mostra un'ampiezza di picco del flusso registrato nei vasi sanguigni. h, i Una fusione e una sovrapposizione della mappa di flusso Doppler g e dell'immagine optoacustica f, che mostrano le ampiezze di picco mentre il rosso e il blu Doppler si spostano rispetto alla posizione del trasduttore. j Una sovrapposizione di mappe Doppler con spostamento verso il rosso e il blu sulla scansione galvanometrica nel pannello f. Le frecce bianche indicano le direzioni dedotte del flusso sanguigno in vari vasi. k Una scansione del profilo attraverso un singolo capillare nella posizione indicata dalle frecce bianche nella scansione galvanometrica nel pannello g. La linea rossa rappresenta un adattamento parabolico ai dati di spostamento Doppler registrati con una velocità massima del flusso sanguigno di 0,44 mm·s-1. La curva grigia continua mostra le ampiezze di picco in ogni posizione di misurazione. Credito: Luce:scienza e applicazioni . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2.
In questo modo, lo studio ha dimostrato per la prima volta l'uso della microscopia optoacustica nel dominio della frequenza (FDOM) basata sul rilevamento e sulla demodulazione del segnale. Gli scienziati hanno catturato segnali di ampiezza e fase a frequenze multiple dell'oggetto ripreso. L'allestimento sperimentale collettivo conteneva sorgenti luminose poco costose, illuminazione simultanea a più lunghezze d'onda e misurazioni dirette del flusso basate su Doppler. Negli studi futuri, Kellnberger et al. quantificherà le frequenze di modulazione, la profondità di imaging e aumentare la risoluzione dell'immagine utilizzando una configurazione sperimentale migliorata.
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