Fabbricazione di lenti diverse per smartphone. (a) Obiettivi fabbricati direttamente sullo smartphone con un alloggiamento per fotocamera Modello I. Trasparente, rosso, le lenti gialle e verdi sono state staccate dall'alloggiamento della fotocamera, e una lente blu rimane sulla fotocamera. (b) Lenti fabbricate su un disco di vetro. La lente blu è stata trapiantata sull'alloggiamento della fotocamera, e le lenti rimanenti sono per diversi canali fluorescenti. Credito:Luce:scienza e applicazioni, doi:10.1038/s41377-019-0187-1
Ricercatori negli Stati Uniti e in Cina hanno sviluppato un metodo per trasformare uno smartphone in un microscopio a fluorescenza. Il dispositivo palmare smartphone-microscopio a fluorescenza (HSFM) consente analisi biomediche complesse in modo rapido ed economico. I microscopi a fluorescenza convenzionali svolgono un ruolo importante per rilevare diverse cellule e proteine, ma sono ingombranti e scomodi per le diagnosi point-of-care. Ora scrivendo Luce:scienza e applicazioni , Bo Dai e un team di ricerca interdisciplinare hanno dettagliato l'uso di polimeri liquidi per creare lenti in miniatura a due gocce tinte con solventi colorati. Gli obiettivi erano compatibili con diverse fotocamere per smartphone. Il basso costo, configurazione sperimentale ha permesso loro di osservare e contare le cellule, monitorare l'espressione di geni marcati in modo fluorescente e distinguere tra tessuti normali e tumori. La tecnologia degli smartphone facilmente accessibile e conveniente può contribuire alla scienza frugale e porterà a una migliore amministrazione della medicina personalizzata in loco ed economicamente fattibile.
La microscopia a fluorescenza è onnipresente in molteplici discipline, compresa la biologia cellulare e molecolare, il settore sanitario, monitoraggio ambientale e igiene alimentare. Nella biomedicina e nelle applicazioni cliniche, l'imaging fluorescente può rilevare e tracciare le cellule, proteine e altre molecole di interesse con elevata sensibilità e precisione. I microscopi a fluorescenza convenzionali sono generalmente progettati con componenti ingombranti, che li rendono estremamente difficili per la diagnosi point-of-care in regioni con risorse limitate. Di conseguenza, i microscopi portatili sono uno sviluppo importante su una piattaforma smartphone ideale per la mobilità e l'accessibilità a una vasta gamma di utenti.
I ricercatori avevano precedentemente utilizzato microscopi basati su smartphone per visualizzare le cellule del sangue umane, parassiti dell'acqua e citomegalovirus umano. Per questi sforzi di ricerca hanno incluso elementi chiave come i diodi emettitori di luce (LED) per l'illuminazione, lenti esterne per l'imaging ottico e l'ingrandimento, nonché il filtraggio dell'emissione di fluorescenza per indirizzare la luce. Le lenti polimeriche sono facili da sviluppare e forniscono un potere risolutivo elevato per costruire un microscopio "fai da te" per applicazioni con risorse limitate. Però, a causa dei diversi modelli di smartphone attualmente disponibili, i ricercatori mirano a sviluppare un allegato per la microscopia basata su smartphone il cui design è indipendente da un modello di telefono specifico.
Costruzione della lente composta a colori. (a) Processo di fabbricazione per costruire lenti composite colorate per smartphone con alloggiamenti per fotocamere rotondi sporgenti, così come alloggiamenti per fotocamere meno accessibili. Le lenti composite colorate per telefoni senza lenti sporgenti sono preparate su un disco di vetro autonomo per il posizionamento futuro sull'obiettivo della fotocamera. (b) Una lente gialla è fabbricata direttamente sullo smartphone che ha un alloggiamento della fotocamera rotondo sporgente (modello I). Inserto:l'obiettivo blu pre-preparato si è staccato dall'alloggiamento della fotocamera. (c) Una lente gialla viene trasferita su uno smartphone con l'altro tipo di alloggiamento della fotocamera (Modello II). Inset:la lente gialla per l'installazione sull'alloggiamento della telecamera. (d) blu, trasparente, rosso, giallo, e le lenti verdi sono state fabbricate su dischi di vetro per creare vari filtri di fluorescenza. (e) Diagramma schematico dell'imaging a fluorescenza. Lo smartphone dotato di lente verde serve a catturare la fluorescenza verde da un campione illuminato da un raggio di luce blu. Credito:Luce:scienza e applicazioni, doi:10.1038/s41377-019-0187-1
Per affrontare questa sfida nel presente lavoro, Dai et al. ha sviluppato un microscopio a fluorescenza per smartphone portatile a basso costo (HFSM) in una dimensione portatile. L'HRSM ha utilizzato un'unica lente a colori compatta e multifunzionale per convertire qualsiasi modello di smartphone in un microscopio a fluorescenza senza modificare il design dell'attacco tra i telefoni. Il design sperimentale ha ridotto la complessità del dispositivo HRFM e ne ha consentito l'adozione su una varietà di smartphone. Il prodotto è funzionalmente coerente su più piattaforme di smartphone, facile da usare, basso costo, e può essere prodotto in serie. Il team di ricerca ha utilizzato il dispositivo per dimostrare l'imaging in campo chiaro e fluorescente in diverse applicazioni bioanalitiche all'interno di cellule e tessuti.
Per il modulo HFSM, Dai et al. includeva una lente composta a colori sia per l'imaging che per il filtraggio della luce. Hanno sviluppato la lente in miniatura utilizzando due goccioline ad alto indice di rifrazione, uno dentro l'altro tinto con solventi colorati per trasmettere la luce di emissione desiderata al sensore di immagine. I ricercatori hanno sviluppato due modelli nello studio per (1) sporgere dal retro del telefono (modello I) o (2) rimanere di profilo con il telefono (modello II). Per entrambe le versioni, includevano un design della lente con prepolimero colorato di polidimetilsilossano (PDMS) e polimero di metilfenile (dimetil difenil silossani con terminazione vinilica). Per determinare come la goccia di polimero si è diffusa durante il processo di fabbricazione, i ricercatori hanno calcolato il raggio della gocciolina e la lunghezza del capillare.
Caratterizzando la lente composta di colore. (un, b) Angoli di contatto misurati per l'alloggiamento della fotocamera modello I con volumi di polimero di 9,5 e 22,9 µl. Barra della scala = 2 mm. (C, d) Angoli di contatto misurati per l'alloggiamento della telecamera Modello II, dove il volume del polimero era 12,7 e 21,2 μL. Barra della scala = 2 mm. Lunghezza focale in funzione dei volumi del polimero e del PDMS per l'alloggiamento della fotocamera di (f) Modello I e (e) Modello II, rispettivamente. Immagini del target di risoluzione USAF-1951 con diversi ingrandimenti della fotocamera catturate dalla fotocamera in (g–i) alloggiamento modello I e (j–l) modello II. I riquadri di destra mostrano i profili di intensità lungo il blu, rosso, e linee verdi. Credito:Luce:scienza e applicazioni, doi:10.1038/s41377-019-0187-1
Hanno prima testato e rilevato la gocciolina PDMS per formare una calotta sferica sotto l'influenza della forza di tensione interfacciale e hanno preso in considerazione diversi fattori per determinare la curvatura interna ed esterna della calotta PDMS. Successivamente, quando hanno dotato lo smartphone di lenti fatte di gocce di polimero da 3,2 µl, la fotocamera potrebbe risolvere una linea di 2,76 µm. Poiché la gocciolina di polimero allo stato liquido è rimasta completamente sigillata all'interno del cappuccio PDMS stabile e polimerizzato, il team di ricerca ha evitato problemi associati a vibrazioni meccaniche esterne e disturbi termici o deterioramenti chimici durante il suo utilizzo. Hanno aderito l'obiettivo alla fotocamera come parte dello smartphone da portare in giro comodamente, e potrebbe staccare l'obiettivo dalla fotocamera per sostituirlo con un obiettivo personalizzato diverso per l'imaging.
A SINISTRA:osservazione delle cellule e conteggio delle cellule mediante HSFM. (a–h) Immagini in campo chiaro di cellule HBEC3-KT, cellule 4T1, cellule B16-F0, e celle Hub7. Barra della scala = 100 μm. io, j Immagini di cellule A375 in una camera Fuchs-Rosenthal per l'analisi della concentrazione. Barra della scala = 200 μm. k Risultati del conteggio delle cellule ottenuti dagli smartphone e da un contacellule. A DESTRA:Immagini di fluorescenza di tessuti epatici umani utilizzando l'HSFM. Le lunghezze d'onda di eccitazione per DAPI (fluorescenza blu) e AF488 (fluorescenza verde) erano 365 e 480 nm, rispettivamente. Le immagini sono state catturate dallo smartphone dotato di lente blu e lente verde. L'istogramma è in scala logaritmica. Barre di scala = 50 μm. Credito:Luce:scienza e applicazioni, doi:10.1038/s41377-019-0187-1
Il team di ricerca ha ulteriormente sviluppato e impiegato uno strumento di illuminazione personalizzato nel processo di imaging microscopico per osservare e contare le cellule sotto illuminazione a luce bianca. Usando la configurazione, hanno visto aggregati cellulari cuboidali e fusiformi in piccoli gruppi. Durante gli esperimenti di conteggio delle cellule, Dai et al. distingueva chiaramente le singole cellule e calcolava la concentrazione cellulare, che concordava in modo eccellente con i risultati ottenuti da un contatore di cellule commerciale per convalidare il dispositivo HSFM. Successivamente, gli scienziati hanno incubato tessuti epatici umani con anticorpi marcati con fluorescenza per rilevare caratteristiche normali o difettose utilizzando l'HSFM dotato di una lente verde. Usando il microscopio dello smartphone, Dai et al. immagini accuratamente identificate di tessuti normali, tessuti para-tumorali e tessuti cancerosi. Ad esempio, una maggiore espressione di fluorescenza verde brillante ha confermato la presenza di anomalie, tessuto malato.
Il team di ricerca ha quindi utilizzato l'HSFM con una lente verde per monitorare la trasfezione e l'espressione della proteina fluorescente verde potenziata (EGFP; gene reporter per studiare i processi fisiologici) all'interno di un plasmide. Per questo, hanno trasfettato il gene NLRP3 umano marcato con GFP in una linea di cellule renali embrionali umane 293T ed hanno eccitato le cellule trasfettate con una luce blu di 480 nm per l'emissione di fluorescenza verde brillante. La luce di eccitazione filtrata attraverso la lente verde per l'emissione di fluorescenza, che Dai et al. catturati come macchie verdi usando lo smartphone. I risultati concordano bene per entrambi i modelli di lenti (modello I e II) rispetto ai valori misurati utilizzando un microscopio convenzionale.
A SINISTRA:Immagini di fluorescenza del gene NLRP3 umano marcato con EGFP in cellule 293T utilizzando l'HSFM. Le lunghezze d'onda di eccitazione per DAPI (blu) ed EGFP (verde) erano 365 e 480 nm, rispettivamente. Le immagini sono state catturate dallo smartphone dotato di lente blu e lente verde. Barra della scala = 50 μm. A DESTRA:Valutazione della produzione di superossido utilizzando l'HSFM. (a) Immagini di fluorescenza di cellule HBEC3-KT stimolate da LPS colorate con DAPI e MitoSOX Red ed eccitate a 365 e 520 nm, rispettivamente. Le immagini sono state catturate dallo smartphone dotato di lente blu e lente rossa. Barra della scala = 50 μm. (b) Livelli di superossido mitocondriale nelle cellule HBEC3-KT esposte a LPS a diverse concentrazioni. Credito:Luce:scienza e applicazioni, doi:10.1038/s41377-019-0187-1
Dai et al. successivamente utilizzato il setup per quantificare la produzione di superossido; un marker fisiologico di malattie cardiovascolari e neurodegenerative. Per questo, hanno colorato una linea di cellule epiteliali bronchiali umane HBEC3-KT con MitoSox Red, una sonda fluorogenica in grado di rilevare in modo altamente selettivo il superossido, che hanno prodotto interagendo cellule HBEC3-KT con lipopolisaccaridi (LPS) in questo lavoro. Il team ha osservato un aumento consistente dell'intensità media di fluorescenza di MitoSox Red per supportare la maggiore produzione di superossido dopo l'attivazione di LPS.
In questo modo, Bo Dai e collaboratori hanno fornito un compatto, piattaforma conveniente per la microscopia a fluorescenza utilizzando uno smartphone basato su lenti. La configurazione ha catturato immagini a risoluzione cellulare e un campo visivo (FOV) su scala tissutale. Le capacità si basavano sulla dimensione dei pixel e del sensore di immagine all'interno dello smartphone; una tecnologia in continua evoluzione. Il team di ricerca è stato ispirato da precedenti lavori di ricerca su un obiettivo per smartphone chiamato DOTlens sviluppato altrove. Il lavoro qui presentato può fungere da moduli di obiettivi multifunzionali di nuova generazione per microscopi smartphone portatili sul campo. Dai et al. credo che le applicazioni osservate siano solo la punta dell'iceberg con un potenziale maggiore per applicazioni future con il dispositivo HSFM. Si aspettano di sviluppare lenti composte di colore per ulteriori canali fluorescenti per migliorare significativamente le capacità del microscopio economico. Gli scienziati prevedono la produzione di massa di prodotti a basso costo, semplici dispositivi HFSM per applicazioni sanitarie mobili e personalizzate presso il punto di cura.
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