Con una tecnica combinata di raggi X avanzata, gli scienziati hanno tracciato nanocarrier per i farmaci antitubercolari all'interno delle cellule con altissima precisione. Il metodo combina due sofisticate misurazioni a raggi X a scansione e può individuare piccole quantità di vari metalli in campioni biologici ad altissima risoluzione, come una squadra attorno alla scienziata DESY Karolina Stachnik riporta sulla rivista Rapporti scientifici . Per illustrare la sua versatilità, i ricercatori hanno anche utilizzato il metodo combinato per mappare il contenuto di calcio nelle ossa umane, un'analisi che può giovare alla ricerca sull'osteoporosi.

"I metalli giocano un ruolo chiave in numerosi processi biologici, dal trasporto di ossigeno nei nostri globuli rossi e dalla mineralizzazione delle ossa al dannoso accumulo di metalli nelle cellule nervose come si vede in malattie come l'Alzheimer, " spiega Stachnik che lavora nel Center for Free-Electron Laser Science (CFEL) presso DESY. I raggi X ad alta energia fanno illuminare i metalli in fluorescenza, un metodo molto sensibile anche a piccole quantità. "Però, le misurazioni della fluorescenza a raggi X di solito non mostrano l'ultrastruttura di una cellula, Per esempio, " dice lo scienziato di DESY Alke Meents che ha guidato la ricerca. "Se vuoi localizzare esattamente i metalli all'interno del tuo campione, devi combinare le misurazioni con una tecnica di imaging." L'ultrastruttura comprende i dettagli della morfologia cellulare che non sono visibili al microscopio ottico.

Come campioni biologici, come le cellule, sono molto sensibili ai raggi X, è estremamente vantaggioso visualizzare la loro struttura contemporaneamente all'analisi di fluorescenza. Per questa ragione, il team ha combinato le misurazioni della fluorescenza con un metodo di imaging noto come pticografia. "Un microscopio tticografico è abbastanza simile a prendere un'immagine panoramica, " spiega Stachnik. "Un campione esteso come una cellula biologica viene scansionato raster con un piccolo raggio di raggi X coerente che produce molte immagini sovrapposte di parti del campione. Queste immagini sovrapposte vengono poi cucite insieme in seguito".

Il metodo applicato funziona senza lenti tra il campione e il rivelatore, e di conseguenza sul rivelatore vengono registrati i cosiddetti pattern di diffrazione di raggi X. Ciascuno di questi pattern contiene informazioni sulla struttura spaziale della rispettiva parte del campione, che può essere calcolato dal modello. "Questo si traduce finalmente in una mappa della densità ottica completamente quantitativa del campione, " spiega Stachnik. "Attraverso questo processo complesso, la tticografia fornisce risoluzioni spaziali oltre i limiti consueti dell'ottica a raggi X."

Grazie alla sua natura di scansione, la tticografia può essere combinata con l'acquisizione simultanea di misurazioni di fluorescenza a raggi X che forniscono un'impronta digitale unica degli elementi costituenti il ​​campione. In questo modo, una fotografia della morfologia del campione ottenuta mediante pticografia può essere sovrapposta a una mappa degli elementi. "La combinazione simultanea di questi due metodi di imaging complementari consente quindi correlazioni prive di artefatti di oligoelementi con la struttura del campione altamente risolta, " riassume Mements.

Requisito fondamentale è che i raggi X siano di un solo colore (monocromatico, tutti aventi la stessa lunghezza d'onda) e che oscillano a passo (coerenti) come in un laser. "Raggi X monocromatici sufficientemente luminosi e coerenti con energie sufficientemente elevate da consentire la fluorescenza di metalli come il ferro sono diventati disponibili solo presso le moderne sorgenti di luce di sincrotrone come PETRA III di DESY, " dice Meents.

Per testare il metodo, i ricercatori di DESY hanno collaborato con il gruppo di Ulrich Schaible del Centro di ricerca Borstel per studiare la localizzazione e la concentrazione di nanocarrier per i farmaci antitubercolari all'interno dei macrofagi, le cellule spazzine del sistema immunitario. "Generalmente, i macrofagi distruggono agenti patogeni come virus e batteri. Sfortunatamente, i batteri della tubercolosi sono riusciti a sfuggire alla distruzione e a nascondersi all'interno dei macrofagi, anche usandoli per crescere, " dice Schaible. "Come barriera per un trattamento efficace, le nicchie dei batteri all'interno dei macrofagi devono essere raggiunte dagli antibiotici per essere efficienti".

Una nuova strategia del "cavallo di Troia" utilizza contenitori di ferro di dimensioni nanometriche per fornire antibiotici direttamente nelle cellule. Questi contenitori sono cavi, riempito di antibiotici e misura meno di 20 nanometri di diametro (un nanometro è un milionesimo di millimetro). "I macrofagi ingoiano i contenitori, e una volta dentro la cella, le pareti di ferro delle gabbie si dissolvono lentamente a causa della necessità dei batteri per il ferro. Infine, gli antibiotici vengono rilasciati e uccidono i batteri, " spiega Schaible.

Per valutare l'efficacia di questa strategia, il team ha studiato i macrofagi che erano stati nutriti con contenitori di ferro. Utilizzando uno stadio di scansione appositamente sviluppato sulla linea di luce di bio-imaging e diffrazione P11 della sorgente di raggi X PETRA III di DESY, i ricercatori hanno potuto catturare immagini tticografiche e di fluorescenza di 14 cellule con risoluzione subcellulare e hanno identificato un totale di 22 agglomerati di nanocontenitori al loro interno.

In una seconda applicazione i ricercatori hanno collaborato con il gruppo di Björn Busse del Centro medico universitario Hamburg-Eppendorf (UKE) e hanno analizzato il contenuto di calcio in un campione di osso umano. "Il calcio è un elemento chiave che rende le nostre ossa forti, " spiega la coautrice Katharina Jähn del gruppo di Busse. "Tuttavia, in periodi di elevato fabbisogno di calcio, il corpo lo dissolve dalle ossa per essere usato altrove. Questi e altri processi legati all'età possono portare all'osteoporosi, colpisce quasi un quarto di tutte le donne di età superiore ai 50 anni in Germania".

La ricerca sperimentale sulla mineralizzazione ossea viene solitamente eseguita su piccole fette di osso. "Però, solo il contenuto totale di calcio viene solitamente mappato in questo modo, " dice Stachnik. "Per ottenere una misura esatta della concentrazione di calcio, si deve correggere per lo spessore spesso variabile del campione". Il team ha utilizzato un'immagine tticografica ottenuta simultaneamente per rimuovere la distorsione dello spessore di massa dalla mappa di distribuzione del calcio. "Con questo approccio siamo stati in grado di osservare un contenuto di calcio localmente inferiore a alcuni punti dell'osso, che aiuta a comprendere meglio il processo dei disturbi ossei e a quantificare l'effetto dei cambiamenti di mineralizzazione ossea nei pazienti, " sottolinea Stachnik.

Per migliorare ulteriormente il metodo, i ricercatori hanno iniziato ad estendere l'analisi alle misurazioni tridimensionali. "La configurazione sperimentale è attualmente in fase di estensione per consentire l'acquisizione di set di dati tomografici 3-D alla linea di luce P11, " dice Meents. "Con molti sincrotroni aggiornati per produrre raggi X ancora più luminosi, ci aspettiamo che il metodo aumenti la produttività e diventi un'applicazione di routine in queste strutture".

Il Centro Ricerche Borstel, l'Istituto Paul Scherrer in Svizzera, l'Istituto di tecnologia di Karlsruhe, l'University Medical Center Hamburg-Eppendorf e DESY sono stati coinvolti in questa ricerca.

DESY è uno dei principali centri di accelerazione di particelle al mondo e studia la struttura e la funzione della materia, dall'interazione di minuscole particelle elementari e il comportamento di nuovi nanomateriali e biomolecole vitali ai grandi misteri dell'universo. Gli acceleratori di particelle ei rivelatori che DESY sviluppa e costruisce nelle sue sedi ad Amburgo e Zeuthen sono strumenti di ricerca unici. Generano la radiazione di raggi X più intensa al mondo, accelerare le particelle per registrare le energie e aprire nuove finestre sull'universo. DESY è membro dell'Associazione Helmholtz, La più grande associazione scientifica tedesca, e riceve i suoi finanziamenti dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (BMBF, 90 per cento) e gli stati federali tedeschi di Amburgo e Brandeburgo (10 per cento).