Ricercatori dell'Unità QWM, Il Dr. Hidehito Adaniya (a sinistra) e il Dr. Martin Cheung (a destra) mostrano il nuovo microscopio crioelettronico. Credito:Okinawa Institute of Science and Technology
Visualizzare la struttura dei virus, proteine e altre piccole biomolecole possono aiutare gli scienziati a ottenere informazioni più approfondite su come funzionano queste molecole, potenzialmente portando a nuovi trattamenti per la malattia. Negli ultimi anni, una potente tecnologia chiamata microscopia elettronica criogenica (crio-EM), dove i campioni congelati sono incorporati in ghiaccio simile al vetro e sondati da un fascio di elettroni, ha rivoluzionato l'imaging delle biomolecole. Però, i microscopi su cui si basa la tecnica sono proibitivi e complicati da usare, rendendoli inaccessibili a molti ricercatori.
Ora, gli scienziati dell'Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University (OIST) hanno sviluppato un microscopio crioelettronico più economico e più facile da usare, che alla fine potrebbe mettere la crio-EM alla portata di migliaia di laboratori.
In un processo di costruzione di sei anni, il team ha costruito il microscopio aggiungendo una nuova funzione di imaging a un microscopio elettronico a scansione. Hanno usato il microscopio ibrido per visualizzare tre diverse biomolecole:due virus dalla forma distinta e una proteina del lombrico.
"Costruire questo microscopio è stato un processo lungo e impegnativo, quindi siamo entusiasti dei suoi risultati finora, " ha detto il dottor Hidehito Adaniya, un ricercatore dell'Unità di Microscopia a Onde Quantiche (QWM) e co-primo autore dello studio, pubblicato in Ultramicroscopia . "Oltre ad essere più economico e semplice da usare, il nostro microscopio utilizza elettroni a bassa energia, che potrebbe potenzialmente migliorare il contrasto delle immagini."
Attualmente, cryo-EM funziona sparando elettroni ad alta energia su un campione biologico. Gli elettroni interagiscono con gli atomi nella biomolecola e si disperdono, cambiando la loro direzione. Gli elettroni dispersi poi colpiscono i rivelatori, e il modello di dispersione specifico viene utilizzato per creare un'immagine del campione.
Le due modalità convenzionali di un microscopio elettronico a scansione (SEM e STEM; sinistra e centro) non sono state in grado di generare immagini delle biomolecole. Però, modalità di imaging olografico (a destra), può essere utilizzato per l'immagine di biomolecole, come mostrato il virus del mosaico del tabacco. Credito:modificato da M Cheung, H Adaniya, C Cassidy, M Yamashita, T Shintake. Imaging olografico elettronico a bassa energia in linea di piccole biomolecole incorporate nel ghiaccio vitreo utilizzando un microscopio elettronico a scansione modificato. Ultramicroscopia, 209 (2020) 112883, Figura 3.
Ma ad alte energie, solo un numero relativamente piccolo di questi eventi di dispersione si verifica perché gli elettroni interagiscono molto debolmente con gli atomi nel campione mentre sfrecciano oltre.
"Le biomolecole sono prevalentemente composte da elementi con una bassa massa atomica, come il carbonio, azoto, idrogeno e ossigeno, " ha spiegato co-autore e ricercatore, Il dottor Martin Cheung. "Questi elementi più leggeri sono praticamente invisibili agli elettroni ad alta velocità".
In contrasto, gli elettroni a bassa energia viaggiano più lentamente e interagiscono più fortemente con gli elementi più leggeri, creando eventi di dispersione più frequenti.
Questa forte interazione tra elettroni a bassa energia ed elementi più leggeri è difficile da sfruttare, però, perché lo strato di ghiaccio che circonda il campione disperde anche gli elettroni, creando rumore di fondo che maschera le biomolecole. Per superare questo problema, gli scienziati hanno adattato il microscopio in modo che potesse passare a una tecnica di imaging diversa:l'olografia crioelettronica.
In modalità di imaging olografico, il fascio di elettroni abbraccia l'intero campione, formando un'onda di riferimento e un'onda oggetto. Queste onde poi interferiscono tra loro per formare un ologramma, che viene registrato da un rilevatore. Credito:modificato da M Cheung, H Adaniya, C Cassidy, M Yamashita, T Shintake. Imaging olografico elettronico a bassa energia in linea di piccole biomolecole incorporate nel ghiaccio vitreo utilizzando un microscopio elettronico a scansione modificato. Ultramicroscopia, 209 (2020) 112883, Figura 2.
Formare l'ologramma
In modalità olografica, un cannone elettronico spara un fascio di elettroni a bassa energia verso il campione in modo che parte del fascio di elettroni passi attraverso il ghiaccio e il campione, formando un'onda oggetto, mentre l'altra parte del fascio di elettroni passa solo attraverso il ghiaccio, formando un'onda di riferimento. Le due parti del fascio di elettroni interagiscono quindi tra loro, come le increspature che si scontrano in uno stagno, creando un modello distinto di interferenza:l'ologramma.
Sulla base del modello di interferenza dell'ologramma, i rivelatori possono distinguere la dispersione da parte del campione dalla dispersione dal film di ghiaccio. Gli scienziati possono anche confrontare le due parti del raggio per ottenere ulteriori informazioni dagli elettroni difficili da rilevare utilizzando la crio-EM convenzionale.
"L'olografia elettronica ci fornisce due diversi tipi di informazioni:ampiezza e fase, mentre le tecniche convenzionali di microscopia crioelettronica possono rilevare solo fase, " ha affermato il dottor Adaniya. Queste informazioni aggiuntive potrebbero consentire agli scienziati di acquisire maggiori conoscenze sulla struttura del campione, Lui ha spiegato.
Il ghiaccio cristallino si forma quando il vapore acqueo atmosferico si raffredda e cristallizza a contatto con il campione super raffreddato. I ricercatori devono quindi eseguire la procedura di preparazione in un vano portaoggetti riempito di azoto per evitare qualsiasi contatto con l'acqua. Credito:Okinawa Institute of Science and Technology
Una svolta nel ghiaccio sottile
Oltre a costruire il microscopio ibrido, gli scienziati hanno anche dovuto ottimizzare la preparazione del campione. Poiché gli elettroni a bassa energia sono più inclini a essere dispersi dal ghiaccio rispetto agli elettroni ad alta energia, il film di ghiaccio che avvolgeva il campione doveva essere il più sottile possibile per massimizzare il segnale. Gli scienziati hanno utilizzato scaglie di ossido di grafene idrato per mantenere in posizione le biomolecole, permettendo la formazione di pellicole di ghiaccio più sottili.
Gli scienziati hanno anche dovuto adottare misure speciali per prevenire la formazione di ghiaccio cristallino, che è "una cattiva notizia per l'imaging crio-EM, " disse Cheung.
Con l'attuale configurazione e campioni ottimizzati, il microscopio produceva immagini con una risoluzione fino a pochi nanometri, che i ricercatori riconoscono è di gran lunga inferiore alla risoluzione quasi atomica raggiunta dalla crio-EM convenzionale.
Ma anche con l'attuale risoluzione, il microscopio riempie ancora una nicchia importante come microscopio di pre-screening. "Poiché gli elettroni a bassa energia interagiscono così fortemente con il ghiaccio, il nostro microscopio più economico e di facile utilizzo può aiutare i ricercatori a misurare la qualità del ghiaccio prima di spendere tempo e denaro preziosi utilizzando microscopi crio-EM convenzionali, " ha detto il dottor Adaniya.
L'intero processo è semplice e veloce, dicono i ricercatori. La modalità SEM/STEM aiuta gli scienziati a individuare il punto migliore per l'imaging, seguita da una transizione senza soluzione di continuità nella modalità olografica. Cosa c'è di più, la capacità di questa tecnologia di commutazione di modalità di essere implementata in altri microscopi elettronici a scansione commerciali lo rende un metodo di imaging ampiamente adottabile.
Nel futuro, il team spera di migliorare ulteriormente la risoluzione dell'immagine, cambiando il cannone elettronico con uno che crea un fascio di elettroni di qualità superiore. "Questo sarà il prossimo passo avanti, " loro hanno detto.
