un, Un raggio laser collimato viene inviato nella configurazione da un divisore di raggio (BS) e su uno specchio di scansione galvanometrico (GSM), che viene ripreso nel piano focale posteriore di un obiettivo aereo (OBJ1). La scansione del GSM rasterizza la messa a fuoco in una dimensione, come mostrato dalla freccia a doppia punta nello spazio focale anteriore in scatola di OBJ1. Uno specchio a gradino riflette la luce con diverse quantità di sfocatura nell'obiettivo, che poi viaggia attraverso le lenti sul GSM, dove viene de-scansionato da, che rimuove il movimento di scansione laterale e rimane solo la componente assiale. Il GSM viene quindi nuovamente ripreso sul piano focale posteriore di un obiettivo a immersione in acqua (OBJ2). OBJ2 forma un'immagine priva di aberrazioni del focus (come formato da OBJ1) nello spazio campione. B, Visualizzazione ingrandita della regione inquadrata da a. Il pannello a sinistra mostra il fuoco della luce al suo fuoco nominale. Le frecce nere mostrano i raggi marginali che ritornano dopo la riflessione. Ogni passo sullo specchio si traduce in un punto di messa a fuoco nel piano del campione con una posizione assiale spostata. C, Configurazione alternativa con specchio inclinato che consente la scansione assiale continua. Qui, l'obiettivo remoto OBJ1 è leggermente spostato fuori dall'asse ottico per creare un fuoco inclinato incidente normale alla superficie dello specchio. La scansione laterale di questo focus si traduce in un cambiamento di focus, come illustrato dalle frecce nere Credito:Tonmoy Chakraborty, Binging Chen, Stephan Daetwyler, Bo Jui Chang, Oliver Vanderpoorten, Etai Sapoznik, Clemente Kaminski, Tuomas PJ Knowles, Kevin M. Dean, e Reto Fiolka
Nella microscopia ottica, l'imaging volumetrico ad alta velocità è limitato dalla bassa velocità di scansione assiale o dalle aberrazioni introdotte dal meccanismo di scansione z. Per superare questi limiti, gli scienziati della UT Southwestern hanno introdotto un nuovo design ottico che trasforma un movimento di scansione laterale in una scansione nella terza dimensione. Il loro microscopio ha realizzato una messa a fuoco laser a una velocità di 12 kHz e ha permesso l'osservazione di dinamiche veloci all'interno delle cellule e del cuore pulsante negli embrioni di Zebrafish.
L'imaging veloce è di grande interesse in microscopia, visione computerizzata, e lavorazione laser. Per esempio, nelle neuroscienze, l'imaging volumetrico ad alta velocità è essenziale per monitorare i processi biologici dinamici, compresa l'attività del voltaggio di membrana (con dinamica sulla scala temporale di 1 ms o meno) o il flusso sanguigno cerebrale. La velocità con cui si può visualizzare l'immagine è strettamente connessa alla velocità con cui si può cambiare la posizione della messa a fuoco del sistema di imaging, soprattutto nella terza dimensione.
I metodi tradizionali per rifocalizzare lo fanno spostando meccanicamente l'obiettivo del microscopio o il campione, il che porta a una bassa velocità di scansione nella terza dimensione poiché la velocità di movimento degli oggetti fisici è limitata dall'inerzia. Un modo potenziale per alleviare questo problema è attraverso la messa a fuoco remota, che realizza la rifocalizzazione modificando il fronte d'onda del sistema ottico. Però, la maggior parte delle tecnologie esistenti affronta il compromesso tra risoluzione e velocità. Come tale, rimane la necessità di una tecnologia di scansione 3D in grado di raggiungere frequenze multi-kHz evitando aberrazioni che ne ridurrebbero la risoluzione.
In un manoscritto pubblicato in Scienza e applicazioni della luce , un team di scienziati, guidato dal Professor Reto Fiolka del Dipartimento di Biologia Cellulare e dal Dipartimento di Bioinformatica di Lyda Hill, presso l'UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX, STATI UNITI D'AMERICA., e i colleghi hanno sviluppato un nuovo design ottico per superare queste sfide. Hanno impiegato tecnologie di scansione laterale consolidate e hanno trasformato il movimento della scansione laterale in una rifocalizzazione nella terza dimensione per realizzare immagini volumetriche ad alta velocità. Hanno preso il concetto di messa a fuoco remota senza aberrazioni, e invece di spostare un corrispondente specchio remoto nella terza dimensione, hanno scansionato un punto laser lateralmente con un galvanometro ad alta velocità su uno specchio fisso. Se la distanza tra lo specchio stazionario e la lente dell'obiettivo non è costante lungo la direzione di scansione, sarà introdotto un defocus come necessario per la rifocalizzazione a distanza. Per di più, sulla via del ritorno, la componente di scansione laterale è perfettamente compensata, tale da ottenere un puro movimento di scansione nella terza dimensione. In tal modo, i ricercatori sono stati in grado di sfruttare le tecnologie di scansione laterale ad alta velocità per spostare rapidamente un fuoco laser ad alta risoluzione nella terza dimensione.
un, Nanoparticelle multimeriche geneticamente codificate all'interno di due cellule MV3, come ripreso da ASLM a 20 ms di tempo di integrazione dell'immagine, e 3,57 volumi al secondo. B, Vista YZ della regione perinucleare. I cerchi gialli indicano le vescicole rilevate e le linee blu illustrano le tracce cumulative. C, Disegno schematico dell'embrione di zebrafish. D, Sezione trasversale XZ media (oltre 30 cicli) del cuore di zebrafish, acquisito con un framerate di 45 Hz. e, Chimografo del cuore che batte, misurato lungo la linea mostrata in d. Kymograph utilizza dati grezzi e non è stata applicata alcuna media. F, Imaging volumetrico di un cuore di zebrafish a una frequenza di volume di 7,4 Hz, Vista XY con profondità codificata a colori. Barra della scala, un, 10 micron; B, 1 micron; D, e 20 micron Credito:Tonmoy Chakraborty, Binging Chen, Stephan Daetwyler, Bo Jui Chang, Oliver Vanderpoorten, Etai Sapoznik, Clemente Kaminski, Tuomas PJ Knowles, Kevin M. Dean, e Reto Fiolka
Due implementazioni che utilizzano uno specchio a gradino e uno specchio planare inclinato, sono stati adottati per realizzare questo concetto. Il primo consente dimensioni del passo assiale arbitrariamente grandi su un numero finito di passaggi, e quest'ultimo consente un numero e una dimensione arbitrari di passi assiali ed è in grado di eseguire una scansione continua nella terza dimensione, anche se su un intervallo di scansione più limitato. Con le due implementazioni, gli scienziati introducono applicazioni di questa tecnologia:
"La nostra prima dimostrazione pratica sull'imaging microscopico è stata l'accelerazione della microscopia a foglio di luce a scorrimento assiale (ASLM), che è stato criticato per la sua bassa velocità di acquisizione (circa 10 Hz framerate nelle implementazioni ad alta risoluzione, in precedenza). La nostra nuova tecnologia di scansione consente un'accelerazione di un ordine di grandezza mantenendo l'elevato potere di risoluzione spaziale di questa tecnologia di imaging emergente. In una seconda applicazione, abbiamo implementato la nostra tecnologia di scansione in un microscopio a scansione raster a 2 fotoni ed eseguito immagini volumetriche ad alta risoluzione con una velocità di scansione nella terza dimensione di 12 kHz. Infatti, a questa risoluzione spaziale, il nostro approccio è 6 volte più veloce rispetto alle tecnologie di messa a fuoco prive di aberrazione riportate in precedenza. Abbiamo quindi dimostrato il potenziale della nostra tecnologia per la microscopia intravitale mediante l'imaging del cuore pulsante di un embrione di zebrafish. Riteniamo che ciò apra importanti applicazioni per l'imaging intravitale, soprattutto nelle neuroscienze".
"Entrambe le tecnologie di scansione discreta e continua possono trovare molte applicazioni per l'immagine di diversi strati del cervello quasi contemporaneamente o per acquisire rapidamente interi volumi per misurare i modelli di attivazione neuronale o il flusso sanguigno cerebrale. È importante sottolineare che, a differenza delle tecnologie precedenti, il nostro approccio è pienamente compatibile con i deflettori acusto-ottici e quindi teoricamente in grado di eseguire scansioni su una scala temporale inferiore al microsecondo (ad es.> 1 MHz) nella terza dimensione. Così, utilizzando modelli di scansione Lissajous risonanti, prevediamo la possibilità di imaging volumetrico a frequenze di kHz", prevedono gli scienziati.
