Un nuovo metodo di imaging può catturare immagini del sistema vascolare in profondità nel cervello dei topi. A sinistra è mostrata un'immagine convenzionale di fluorescenza a largo campo del cervello di topo presa in modo non invasivo nello spettro della luce visibile, mentre l'approccio DOLI basato sulla localizzazione non invasivo che opera nella finestra spettrale NIR-II è mostrato a destra. Credito:Daniel Razansky, Università e Politecnico di Zurigo
I ricercatori hanno sviluppato una nuova tecnica che consente l'imaging a fluorescenza microscopica a quattro volte il limite di profondità imposto dalla diffusione della luce. La microscopia a fluorescenza viene spesso utilizzata per visualizzare i dettagli molecolari e cellulari del cervello in modelli animali di varie malattie ma, fino ad ora, è stato limitato a piccoli volumi e procedure altamente invasive a causa dell'intensa diffusione della luce da parte della pelle e del cranio.
"Visualizzazione delle dinamiche biologiche in un ambiente imperturbato, nel profondo di un organismo vivente, è essenziale per comprendere la complessa biologia degli organismi viventi e la progressione delle malattie, " ha affermato il leader del gruppo di ricerca Daniel Razansky dell'Università di Zurigo e dell'ETH di Zurigo, entrambi in Svizzera. "Il nostro studio rappresenta la prima volta che la microscopia a fluorescenza 3D è stata eseguita in modo completamente non invasivo a risoluzione a livello capillare in un cervello di topo adulto, coprendo efficacemente un campo visivo di circa 1 centimetro."
In ottica , i ricercatori descrivono la loro nuova tecnica, che si chiama imaging di localizzazione ottica diffusa (DOLI). Sfrutta quella che è nota come la seconda finestra spettrale del vicino infrarosso (NIR-II) da 1000 a 1700 nanometri, che mostra meno dispersione.
"Consentire osservazioni ottiche ad alta risoluzione nei tessuti viventi profondi rappresenta un obiettivo di lunga data nel campo dell'imaging biomedico, " ha affermato Razansky. "La superba risoluzione di DOLI per le osservazioni ottiche dei tessuti profondi può fornire approfondimenti funzionali nel cervello, rendendolo una piattaforma promettente per lo studio dell'attività neurale, microcircolo, accoppiamento neurovascolare e neurodegenerazione".
La nuova tecnica denominata imaging di localizzazione ottica diffusa (DOLI) sfrutta la finestra spettrale NIR-II da 1000 a 1700 nanometri, che mostra meno dispersione. Il primo autore Quanyu Zhou è mostrato con l'impostazione dell'immagine. Credito:Daniel Razansky, Università di Zurigo e ETH Zurich
Raggiungere una maggiore profondità
Per la nuova tecnica, i ricercatori iniettano per via endovenosa un topo vivente con microgoccioline fluorescenti a una concentrazione che crea una distribuzione sparsa nel flusso sanguigno. Il monitoraggio di questi bersagli fluidi consente la ricostruzione di una mappa ad alta risoluzione della microvascolarizzazione cerebrale profonda nel cervello del topo.
"Il metodo elimina la dispersione della luce di fondo e viene eseguito con il cuoio capelluto e il cranio intatti, ", ha detto Razansky. "È interessante notare che abbiamo anche osservato una forte dipendenza della dimensione dello spot registrato dalla fotocamera dalla profondità delle microgoccioline nel cervello, che ha consentito l'imaging risolta in profondità."
Il nuovo approccio beneficia della recente introduzione di termocamere ad infrarossi a onde corte altamente efficienti basate su sensori InGaAs. Un altro elemento chiave è stato l'uso di nuovi agenti di contrasto che mostrano forti risposte di fluorescenza nella finestra NIR-II, come punti quantici a base di solfuro di piombo (PbS).
I ricercatori hanno testato la nuova tecnica in fantasmi di tessuto che imitano le proprietà medie del tessuto cerebrale, dimostrando che potevano acquisire immagini a risoluzione microscopica a profondità fino a 4 millimetri in tessuti otticamente opachi. Credito:Daniel Razansky, Università di Zurigo e ETH Zurich
Immagini nitide e chiare
I ricercatori hanno prima testato la nuova tecnica in modelli sintetici di tessuto noti come fantasmi di tessuto che imitano le proprietà medie del tessuto cerebrale, dimostrando che potevano acquisire immagini a risoluzione microscopica a profondità fino a 4 millimetri in tessuti otticamente opachi. Hanno quindi eseguito DOLI in topi viventi in cui la microvascolarizzazione cerebrale, nonché la velocità e la direzione del flusso sanguigno potevano essere visualizzate in modo completamente non invasivo.
I ricercatori stanno lavorando per ottimizzare la precisione in tutte e tre le dimensioni per migliorare la risoluzione di DOLI. Stanno anche sviluppando agenti fluorescenti migliorati che sono più piccoli, hanno una maggiore intensità di fluorescenza e sono più stabili in vivo. Ciò aumenterà in modo significativo le prestazioni di DOLI in termini di segnale/rumore ottenibile e profondità di imaging.
"Ci aspettiamo che DOLI emergerà come un potente approccio per l'imaging a fluorescenza di organismi viventi a regimi di risoluzione e profondità precedentemente inaccessibili, " ha detto Razansky. "Ciò migliorerà notevolmente l'applicabilità in vivo della microscopia a fluorescenza e delle tecniche di tomografia".
