Il laser a bassa frequenza eccita più segnali di fluorescenza. Credito:per gentile concessione di T. Qiao (HKU).
La microscopia a due fotoni (2PM) svolge un ruolo affidabile ed efficiente nell'imaging non invasivo dei tessuti profondi nelle indagini biomediche. Dall'invenzione del microscopio a due fotoni alla fine del 20° secolo, c'è stato un flusso costante di ricerche correlate che hanno fatto progredire le 14:00 - dai fluorofori ai metodi e alle applicazioni di imaging - nei campi della biochimica e della medicina.
Come visualizzare i tessuti più profondi è stata una grande sfida nell'imaging a due fotoni. Le sorgenti laser possono potenzialmente affrontare questa sfida. Tuttavia, il tradizionale laser Ti:zaffiro con modalità bloccata per l'imaging a due fotoni è limitato dalla sua elevata frequenza di ripetizione e non può fornire l'elevata energia dell'impulso necessaria per l'imaging dei tessuti profondi a bassa potenza di esposizione. Il laser a fibra supera convenientemente l'elevata frequenza di ripetizione aggiungendo alcune decine di metri di fibre nella cavità, ma in alcuni casi soffre di bassi guadagni e di un basso rapporto segnale/rumore (SNR).
Di recente, come riportato in Advanced Photonics Nexus , i ricercatori dell'Omega Group di Kenneth Wong dell'Università di Hong Kong (HKU) hanno sviluppato un laser ad alte prestazioni come nuovo tipo di sorgente di luce per la microscopia multifotonica. Hanno riportato un laser a 937 nm, frequenza raddoppiata rispetto a un laser in modalità bloccata interamente in fibra a 1,8 μm, con una bassa frequenza di ripetizione di ~ 9 MHz e un SNR elevato di 74 dB.
La nuova sorgente laser a 937 nm si basa sulla modulazione autofase nella fibra monomodale per aumentare contemporaneamente la potenza di 1,8 μm e comprimere l'ampiezza dell'impulso. Il design del laser a 937 nm è adatto per l'imaging dei tessuti profondi ad alta sensibilità di proteine a fluorescenza multiple. La sorgente di luce laser fornisce eccitazioni a due fotoni su più tipi di tessuto biologico. La profondità di penetrazione dimostrata con un cervello di topo ha raggiunto 620 μm, rivelando la capacità di questa tecnica per l'imaging dei tessuti profondi. I ricercatori hanno anche condotto l'imaging di seconda generazione armonica (SHG), dimostrando l'imaging senza etichetta e convalidando inizialmente il potenziale di questa sorgente di luce per applicazioni di imaging multimodale.
Risultati di imaging a due fotoni, basati sul nuovo laser a 937 nm. (a) e (b) Immagini a fluorescenza a due fotoni di neuroni e fibre etichettati con YFP in una fetta di cervello di topo. ( c ) Due immagini di fluorescenza fotonica dei vasi lipofili colorati con tracciante a diverse profondità del cervello del topo. (d) Ricostruzione 3D delle immagini di neuroni cerebrali di topo marcati con EGFP. Credito:He, Tang, et al., doi 10.1117/1.APN.1.2.026001.
Thanks to its low repetition frequency and high signal-to-noise ratio, the light source requires only 10 mW of power to image tissue at depths of over 600 µm, significantly lower than the 40-MHz fiber laser, which requires approximately 200-mW power at a similar depth. This greatly reduces photobleaching and photodamage in imaging, improving the depth of tissue imaging and safety in live (in vivo) imaging.
This work will facilitate greater insights into deep tissue imaging for research and biomedical applications. Postdoctoral fellow at HKU and corresponding author Tian Qiao remarks that "this novel high-SNR 937-nm laser source achieves a good balance between sensitivity, penetration depth, and imaging speed for two-photon imaging. Its great performance in two-photon imaging indicates its exciting potential for biological investigations, such as in vivo deep-tissue imaging and multimode imaging." + Esplora ulteriormente
