I ricercatori hanno sviluppato un approccio di spettroscopia Raman senza etichetta e non invasivo in grado di acquisire immagini microscopiche di campioni biologici e identificare un'ampia gamma di biomolecole con velocità e sensibilità senza precedenti.

"Il nostro lavoro potrebbe portare a un dispositivo non invasivo, privo di etichetta e di facile utilizzo per uso clinico", ha affermato il leader del team di ricerca Dario Polli del Politecnico di Milano in Italia. "Questo microscopio innovativo, insieme ad algoritmi basati sull'apprendimento profondo, potrebbe eventualmente rendere più facile e veloce la diagnosi del cancro consentendo la visualizzazione dei costituenti chimici dei tessuti e delle cellule umane."

Nella rivista Optics Express , i ricercatori descrivono la loro nuova tecnica, che si basa sulla microscopia coerente anti-stokes Raman scattering (CARS). La microscopia CARS produce immagini basate sulle firme vibrazionali delle molecole sfruttando l'interazione tra impulsi laser ultracorti e campioni biologici.

Il nuovo approccio fornisce l'accesso alla regione difficile da rilevare dello spettro vibrazionale nota come regione dell'impronta digitale, che va da 400 a 1800 cm ⁻¹ . Sebbene molti singoli composti possano essere identificati utilizzando le loro impronte vibrazionali in questa regione, tende a produrre segnali deboli che sono difficili da rilevare.

"Le tecniche comunemente utilizzate nelle scienze biomediche richiedono spesso la colorazione, che non solo è ingombrante ma può anche introdurre alterazioni strutturali e chimiche che possono portare ad artefatti, o errori, nell'imaging e nell'elaborazione dei dati", ha affermato Polli. "Poiché il nostro sistema è in grado di distinguere tra molte specie chimiche diverse nei tessuti biologici senza etichette, potrebbe essere utile per l'imaging di cellule vive e l'analisi di biopsie tissutali".

Tasso di ripetizione più basso, imaging più veloce

Questo nuovo lavoro fa parte del progetto CRIMSON, che mira a sviluppare un dispositivo di imaging chiavi in ​​mano che utilizzi la spettroscopia vibrazionale per la classificazione rapida di cellule e tessuti. L'obiettivo del progetto è trasformare lo studio dell'origine cellulare delle malattie per abilitare nuovi approcci che potrebbero far avanzare la terapia personalizzata.

Come passo fondamentale verso questo obiettivo, i ricercatori hanno sviluppato un microscopio CARS basato su un laser commerciale che produce impulsi ultracorti con durate di circa 270 femtosecondi nella gamma di lunghezze d'onda del vicino infrarosso. Hanno progettato il sistema di microscopia per utilizzare impulsi laser con una frequenza di ripetizione di 2 MHz, che è molto inferiore ai 40 o 80 MHz utilizzati dalla maggior parte degli altri sistemi CARS.

Questa frequenza di ripetizione inferiore riduce il danno fototermico al campione perché crea un ritardo di 0,5 microsecondi tra due impulsi consecutivi. Produce anche un'energia di impulso più elevata e un'intensità di picco nel punto focale, che genera un segnale CARS più forte e consente una velocità di acquisizione più rapida.

"Il vantaggio più importante della frequenza di ripetizione inferiore è che ci ha permesso di generare impulsi Stokes a banda larga spostati verso il rosso che coprono l'intera regione vibrazionale dell'impronta digitale utilizzando la generazione del supercontinuum a luce bianca in un cristallo sfuso", ha affermato Federico Vernuccio, dottorando al Politecnico di Milano e primo autore dello studio. "Rispetto ad altri metodi, questo approccio è tecnicamente più semplice, più compatto e robusto."

L'uso di una regione spettrale che è spostata verso il rosso rispetto alle configurazioni standard significa che è possibile utilizzare intensità laser più elevate prima dell'inizio del fotodanneggiamento. I ricercatori hanno anche sviluppato nuovi algoritmi che combinano approcci computazionali numerici standard con l'intelligenza artificiale. Questi algoritmi recuperano più informazioni dai dati acquisiti e le trasformano in immagini che consentono di distinguere facilmente diverse specie chimiche.

"Grazie ai nostri miglioramenti, il sistema CARS fornisce immagini di alta qualità a una velocità di acquisizione all'avanguardia", ha affermato Vernuccio. "Il nostro sistema ha un tempo di permanenza dei pixel inferiore a 1 millisecondo senza compromettere l'integrità del campione. Questa velocità è limitata dalla frequenza di aggiornamento dello spettrometro."

Sensibilità ad alta velocità

Per testare il loro sistema, i ricercatori hanno utilizzato campioni di riferimento per confrontare gli spettri recuperati con il nuovo microscopio con quelli acquisiti utilizzando una tecnica di spettroscopia vibrazionale all'avanguardia, sebbene più lenta. I due metodi hanno mostrato un eccellente accordo, dimostrando che il nuovo sistema potrebbe fornire spettri a velocità molto elevate con una buona risoluzione spettrale e specificità chimica.

I ricercatori hanno quindi determinato il limite di rilevamento del loro sistema acquisendo spettri CARS di un insieme di soluzioni di dimetilsolfossido con varie concentrazioni. Il sistema è stato in grado di misurare la concentrazione chimica con la sensibilità senza precedenti di 14,1 mmol/litro, circa il doppio della sensibilità di altri sistemi CARS che lavorano nella regione delle impronte digitali.

Hanno anche mostrato la capacità del sistema di distinguere e localizzare spazialmente varie perle di plastica trasparenti di dimensioni micron in base alla loro firma vibrazionale e hanno effettuato misurazioni da tessuti biologici per dimostrare che la tecnica funziona su campioni biologici senza indurre danni.

"Il nostro microscopio CARS consente l'imaging senza etichetta con specificità chimica a velocità più elevate, rendendo così più fattibile l'imaging Raman delle cellule viventi", ha affermato Polli. "Ciò potrebbe consentire al nostro sistema di essere utilizzato per analizzare le interazioni delle cellule tumorali con le cellule immunitarie o per caratterizzare il modo in cui la chemioterapia influisce sulle cellule, ad esempio."

I ricercatori stanno ora lavorando per migliorare il loro sistema creando una gamma di lunghezze d'onda ancora più ampia di impulsi di Stokes attraverso la generazione del supercontinuum di luce bianca. Ciò migliorerebbe sia la velocità di imaging che il numero di analiti chimici rilevabili. Stanno anche lavorando alla commercializzazione sviluppando software di facile utilizzo, sorgenti ottiche compatte e progetti per un prototipo commerciale e un sistema di rilevamento. + Esplora ulteriormente

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