La produzione di massa di proteine ricombinanti utilizzando “fabbriche” di cellule di lievito necessita di metanolo, un composto che richiede una manipolazione sicura, comporta il rischio di prendere fuoco e talvolta produce sottoprodotti dannosi. I ricercatori del Dipartimento di Biochimica (BC), Indian Institute of Science (IISc), hanno ora sviluppato un processo alternativo più sicuro che si basa invece su un comune additivo alimentare chiamato glutammato monosodico (MSG).
Le proteine ricombinanti, come gli antigeni dei vaccini, l'insulina e gli anticorpi monoclonali, sono prodotte in serie coltivando cellule batteriche, virali o di mammiferi modificate in grandi bioreattori. L'organismo più utilizzato è il lievito Pichia pastoris (ora chiamato Komagataella phaffii). Contiene un promotore unico, una regione genetica specifica che può essere attivata dal metanolo. Questo promotore codifica per un enzima chiamato alcol ossidasi (AOX).
Per produrre in serie una proteina ricombinante, il gene che codifica per quella proteina viene inserito nel genoma del lievito proprio accanto al promotore AOX. Le cellule di lievito vengono quindi alimentate con glicerolo o glucosio come fonte di carbonio. Una volta che si sono formate abbastanza cellule, viene aggiunto metanolo, che poi attiva il promotore AOX, e le cellule iniziano a produrre la proteina ricombinante in quantità abbondanti.
La maggior parte delle industrie utilizza questo processo indotto dal metanolo per produrre proteine ricombinanti. Tuttavia, il metanolo è altamente infiammabile e pericoloso e richiede rigorose precauzioni di sicurezza, sottolinea PN Rangarajan, professore alla BC e autore corrispondente dello studio pubblicato su Microbial Cell Factories . Il metanolo viene anche metabolizzato per formare perossido di idrogeno che può indurre stress ossidativo nelle cellule di lievito o danneggiare le proteine ricombinanti.
Per risolvere questo problema, Trishna Dey, ex Ph.D. studente alla BC, ha iniziato a cercare alternative. Dopo un'approfondita ricerca, il team ha scoperto che il glutammato monosodico (MSG), un additivo alimentare approvato dalla USFDA, può attivare un diverso promotore nel genoma del lievito che codifica per un enzima chiamato fosfoenolpiruvato carbossichinasi (PEPCK). L'attivazione di questo promotore con MSG ha portato alla produzione di proteine simile all'attivazione del promotore AOX da parte del metanolo.
Ottimizzare il terreno di coltura cellulare per questo processo nuovo e non testato è stato impegnativo, afferma Neetu Rajak, primo autore e Ph.D. studente presso BC. Per molto tempo, le cellule di lievito crescevano male nelle fiasche agitate e producevano pochissime proteine ricombinanti. "C'è stato un momento in cui quasi ci arrendevamo perché pensavamo che non avrebbe funzionato", ricorda Rangarajan.
Alla fine il gruppo capì che il solo uso del glutammato monosodico non era sufficiente. Vedanth Bellad e Yash Sharma, assistenti di progetto presso BC e coautori, spiegano di aver provato a integrare la coltura con vari altri composti, finché alla fine uno ha funzionato:l'etanolo.
L'aggiunta di etanolo ha aiutato le cellule a crescere più velocemente, aumentando la biomassa e la quantità di proteine ricombinanti prodotte. L'etanolo è anche più sicuro per le cellule di lievito rispetto al metanolo, poiché non produce sottoprodotti tossici quando viene scomposto.
Per testare il processo, il team ha provato a produrre il dominio di legame del recettore SARS-CoV-2, un antigene vaccinale ampiamente utilizzato che è stato espresso con successo nelle cellule di lievito e di mammifero. Hanno scoperto che il loro nuovo sistema di espressione produceva il doppio della quantità di antigene rispetto al processo indotto dal metanolo.
I ricercatori sperano che questo nuovo e indigeno sistema di espressione possa essere utilizzato nelle industrie biotecnologiche per produrre in serie proteine preziose, tra cui proteine del latte e delle uova, integratori alimentari per bambini e prodotti nutraceutici, oltre alle molecole terapeutiche.
