Il sequenziamento rapido del DNA potrebbe presto diventare una parte di routine della cartella clinica di ogni individuo, fornendo enormi informazioni precedentemente sequestrate nei 3 miliardi di basi nucleotidiche del genoma umano. La sezione NEWSFOCUS di questa settimana della rivista Scienza descrive i recenti progressi nella tecnologia di sequenziamento.

Stuart Lindsay, direttore del Centro per la biofisica delle singole molecole del Biodesign Institute, è in prima linea in questa ricerca, aver affrontato con successo un ostacolo centrale nel sequenziamento dei nanopori:leggere le basi di singoli nucleotidi in una catena di DNA. Gli ultimi risultati sperimentali di Lindsay, che dimostrano miglioramenti critici nelle letture del DNA, sono appena apparsi sulla rivista Nanotecnologia .

Una volta che il sequenziamento accurato scende al di sotto della soglia di $ 1, 000 per genoma, la tecnologia dovrebbe diventare onnipresente, secondo molti. Come suggerisce l'attuale panoramica di Science, quel giorno potrebbe avvicinarsi poiché sia ​​la velocità che il costo del sequenziamento dell'intero genoma avanzano a un ritmo superiore alla famosa Legge di Moore, (che impone il raddoppio della potenza di calcolo – e il dimezzamento della spesa – ogni 18 mesi).

L'ultima competizione tecnologica prevede l'idea di far passare un singolo filamento di DNA attraverso un minuscolo, occhiello su scala molecolare noto come nanoporo. Questa strategia potrebbe presto consentire di leggere l'intera sequenza del DNA in una volta sola, piuttosto che fare a pezzi, decifrato in brevi frammenti e faticosamente ricomposto.

Mentre il primo sequenziamento del genoma umano ha richiesto ai ricercatori 13 anni e 3 miliardi di dollari per raggiungere, sotto gli auspici del Progetto Genoma Umano, l'impresa potrebbe presto essere compiuta alla velocità accecante di 6 miliardi di basi nucleotidiche ogni 6 ore al costo di $ 900. Almeno questa è la stravagante affermazione fatta da Oxford Nanopore Technologies, una delle aziende pionieristiche che guidano i nuovi sviluppi del sequenziamento.

Poiché l'idea apparentemente donchisciottesca del sequenziamento dei nanopori è stata ideata per la prima volta a metà degli anni '90, sono stati fatti enormi progressi. L'idea di base è che quando un nanoporo è immerso in un fluido conduttore e ai suoi capi viene applicata una tensione, la conduzione di ioni attraverso il nanoporo produrrà una corrente elettrica misurabile. Questa corrente è molto sensibile alle dimensioni e alla forma del nanoporo e, in teoria, ogni base nucleotidica nel filo del DNA ostruirà il nanoporo mentre migra, alterando la corrente ionica in modo riconoscibile e riproducibile.

Tuttavia, il "filo" del DNA è un materiale difficile da manipolare, così sottile che ci vorrebbero circa 5000 filamenti di DNA affiancati per eguagliare la larghezza di un capello umano. Trovare un occhiello adatto a questa scala si è rivelato una sfida. All'inizio, poroso, sono state esplorate le proteine ​​transmembrana. Alfa emolisina (αHL), un batterio che provoca la lisi dei globuli rossi, sembrava un candidato particolarmente promettente, dato il diametro dei nanopori richiesto per il sequenziamento del DNA.

Da allora, altri portali a base di proteine ​​per il DNA sono stati modificati e, più recentemente, sono stati studiati vari nanopori “a stato solido” di silicio o grafene. Questi possono essere fabbricati più facilmente e le loro proprietà, più precisamente controllato.

Secondo la revisione di Science sull'attuale stato dell'arte, il sequenziamento dei nanopori “sembra pronto a lasciare il laboratorio, ” e il sogno di un genoma da 1000 dollari potrebbe essere vicino, anche se le sfide rimangono. Un problema persistente nel sequenziamento delle singole basi è stato che tendono a fluire attraverso il nanoporo troppo rapidamente per individuare ciascuna base in modo indipendente. Anziché, la corrente misurata nei primi esperimenti rifletteva la media prodotta da un gruppo di basi che si facevano strada attraverso il tunnel.

La tecnica di Lindsay si basa sulla lettura della corrente elettrica in un minuscolo circuito composto da un nucleotide di DNA intrappolato tra una coppia di elettrodi d'oro, che abbracciano un nanoporo. Gli elettrodi sono realizzati funzionalizzando la punta di un microscopio a scansione a effetto tunnel (STM), con molecole in grado di legare singole basi di DNA mentre infilano la testa attraverso il nanoporo.

Tunnel di riconoscimento, il nome Lindsay si applica al suo metodo di sequenziamento, si basa sull'equipaggiamento di uno dei due elettrodi con sostanze chimiche di rilevamento, l'altro con il bersaglio nucleotidico da rilevare. Viene prodotto un segnale quando la giunzione tra la sostanza chimica di rilevamento e il bersaglio si autoassembla, chiudendo il circuito.

In questo tipo di giunzione, dove le lunghezze che separano gli elettrodi sono ridotte a una scala molecolare, gli elettroni possono esibire comportamenti strani associati al mondo subatomico quantistico, “tunneling” attraverso barriere in condizioni proibite dalla fisica classica. In uno scenario del genere, ciascuno dei 4 nucleotidi dovrebbe produrre una corrente di tunneling caratteristica, che può essere utilizzato per sequenziare il DNA base per base mentre si fa strada attraverso il nanoporo. L'intrappolamento momentaneo di ciascuna base consente di avere il tempo per un'identificazione accurata, prima che venga rilasciato e il filo del DNA continui la sua trasmigrazione attraverso il nanoporo.

La sostituzione del flusso di corrente ionica con la corrente di tunneling può potenzialmente migliorare considerevolmente la risoluzione del sequenziamento e nel loro ultimo lavoro, Il gruppo di Lindsay dimostra che l'analisi multiparametrica dei picchi di corrente prodotti dal tunneling può effettivamente identificare ogni base di DNA poiché è temporaneamente bloccata dal legame idrogeno tra gli elettrodi funzionalizzati.

C'è di più.

Oltre a individuare l'identità del nucleotide con una precisione superiore al 90%, la tecnica permette anche di identificare le modificazioni geniche ambientali, Per esempio, metilazione. Questo rappresenta un importante passo avanti per il sequenziamento, poiché tali alterazioni epigenetiche del genoma hanno profonde implicazioni per lo studio della salute e delle malattie umane, compreso lo sviluppo embrionale e postnatale, e cancro.

L'articolo sulla nanotecnologia descrive un nuovo approccio all'analisi dei segnali di tunneling. Il gruppo di Lindsay ha utilizzato l'apprendimento automatico (il processo utilizzato da Watson di IBM per vincere a Jeopardy) per addestrare un computer a riconoscere le basi del DNA. La macchina ha chiamato tutte e quattro le basi (A, T, C e G) così come la “quinta base” – metile – che porta il codice epigenetico, con un'accuratezza del 96% su una singola molecola letta.

“Oxford Nanopore ha fatto un enorme passo avanti nel sequenziamento dei nanopori utilizzando la corrente ionica, come evidenziato nella storia di NEWSFOCUS, "Dice Lindsay. "Ma pensiamo di poter portare ancora di più sul tavolo con la supersensibilità e la risoluzione chimica del Recognition Tunneling".

Roche Pharmaceuticals ha recentemente concesso in licenza la tecnologia.

La corsa ad alta posta in gioco per il sequenziamento rapido sembra entrare in dirittura d'arrivo, anche se sono probabili nuove sorprese prima del traguardo. Una volta attraversato, l'era della medicina personalizzata sarà arrivata. Quasi sicuramente seguiranno molte nuove intuizioni sulle basi genomiche della salute umana e delle malattie.