I nanopori potrebbero un giorno guidare una rivoluzione nel sequenziamento del DNA. Facendo scorrere le molecole di DNA una alla volta attraverso minuscoli fori in una membrana sottile, potrebbe essere possibile decodificare lunghi tratti di DNA alla velocità della luce. Scienziati, però, non ho ancora capito la fisica di come i filamenti polimerici come il DNA interagiscono con i nanopori. Ora, con l'aiuto di un particolare tipo di virus, i ricercatori della Brown University hanno gettato nuova luce su questa fisica su scala nanometrica.

"Ciò che ci ha interessato a questo è che tutti nel campo hanno studiato il DNA e sviluppato modelli per come interagiscono con i nanopori, " ha detto Derek Stein, professore associato di fisica e ingegneria alla Brown che ha diretto la ricerca. "Ma anche le cose più basilari che speri che i modelli possano prevedere partendo dalle proprietà di base del DNA, non puoi farlo. L'unico modo per uscire da quel solco era studiare qualcosa di diverso".

Le scoperte, pubblicato oggi in Comunicazioni sulla natura , potrebbe non solo aiutare nello sviluppo di dispositivi nanopori per il sequenziamento del DNA, potrebbero anche portare a un nuovo modo di rilevare agenti patogeni pericolosi.

Raddrizzare la fisica

Il concetto alla base del sequenziamento dei nanopori è abbastanza semplice. Un buco largo solo pochi miliardesimi di metro è praticato in una membrana che separa due pozze di acqua salata. Viene applicata una corrente elettrica al sistema, che occasionalmente intrappola un filamento di DNA carico e lo spinge attraverso il poro, un fenomeno chiamato traslocazione. Quando una molecola trasloca, provoca variazioni rilevabili della corrente elettrica attraverso il poro. Osservando attentamente queste variazioni di corrente, gli scienziati potrebbero essere in grado di distinguere i singoli nucleotidi:gli A, C, G e T codificati nelle molecole di DNA.

I primi sequenziatori di nanopori disponibili in commercio potrebbero essere solo pochi anni di distanza, ma nonostante i progressi nel campo, sorprendentemente poco si sa sulla fisica di base coinvolta quando i polimeri interagiscono con i nanopori. Ciò è in parte dovuto alle complessità coinvolte nello studio del DNA. In soluzione, Le molecole di DNA formano palline di scarabocchi casuali, che rendono estremamente difficile la comprensione del loro comportamento fisico.

Per esempio, i fattori che regolano la velocità di traslocazione del DNA non sono ben compresi. A volte le molecole sfrecciano rapidamente attraverso un poro; altre volte strisciano più lentamente, e nessuno capisce completamente il motivo.

Una possibile spiegazione è che la configurazione ondulata del DNA fa sì che ogni molecola sperimenti differenze di resistenza mentre vengono tirate attraverso l'acqua verso il poro. "Se una molecola si accartoccia vicino al poro, ha una distanza più breve da percorrere e sperimenta meno resistenza, " disse Angus McMullen, uno studente laureato in fisica alla Brown e autore principale dello studio. "Ma se è allungato, si sentirebbe trascinare per tutta la lunghezza e ciò lo farebbe rallentare".

L'effetto trascinamento è impossibile da isolare sperimentalmente usando il DNA, ma il virus studiato da McMullen e dai suoi colleghi ha offerto una soluzione.

I ricercatori hanno esaminato fd, un virus innocuo che infetta e. batteri coli. Due cose rendono il virus un candidato ideale per lo studio con i nanopori. Primo, I virus fd sono tutti cloni identici l'uno dell'altro. Secondo, a differenza del DNA ondulato, il virus fd è rigido, molecola a bastoncino. Perché il virus non si accartoccia come fa il DNA, l'effetto del trascinamento su ciascuno dovrebbe essere essenzialmente lo stesso ogni volta.

Con la resistenza eliminata come fonte di variazione nella velocità di traslocazione, i ricercatori si aspettavano che l'unica fonte di variazione sarebbe stata l'effetto del movimento termico. Le minuscole molecole di virus urtano costantemente contro le molecole d'acqua in cui sono immerse. Alcuni calci termici casuali dal retro accelereranno il virus mentre attraversa il poro. Qualche calcio frontale l'avrebbe rallentato.

Gli esperimenti hanno mostrato che mentre il movimento termico spiegava gran parte della variazione nella velocità di traslocazione, non spiegava tutto. Con grande sorpresa dei ricercatori, hanno trovato un'altra fonte di variazione che aumentava quando veniva aumentata la tensione attraverso il poro.

"Pensavamo che la fisica sarebbe stata chiarissima, " ha detto Jay Tang, professore associato di fisica e ingegneria alla Brown e uno dei coautori dello studio. "Hai questo [virus] rigido con diametro e dimensioni ben definiti e ti aspetteresti un segnale molto chiaro. A quanto pare, abbiamo trovato un po' di fisica sconcertante che possiamo spiegare solo in parte da soli".

I ricercatori non possono dire con certezza cosa stia causando la variazione che hanno osservato, ma hanno alcune idee.

"È stato previsto che, a seconda di dove [un oggetto] si trova all'interno del poro, potrebbe essere tirato più forte o più debole, " ha detto McMullen. "Se è al centro del poro, tira un po' più debole che se è proprio sul bordo. Questo è stato previsto, ma mai verificato sperimentalmente. Questa potrebbe essere la prova di ciò che sta accadendo, ma stiamo ancora facendo un lavoro di follow-up".

Verso un sequenziatore nanopori e altro

Una migliore comprensione della velocità di traslocazione potrebbe migliorare l'accuratezza del sequenziamento dei nanopori, dice McMullen. Sarebbe anche utile nel compito cruciale di misurare la lunghezza dei filamenti di DNA. "Se puoi prevedere la velocità di traslocazione, " ha detto McMullen, "quindi puoi facilmente ottenere la lunghezza del DNA da quanto tempo è stata la sua traslocazione".

La ricerca ha anche aiutato a rivelare altri aspetti del processo di traslocazione che potrebbero essere utili nella progettazione di dispositivi futuri. Lo studio ha dimostrato che la corrente elettrica tende ad allineare i virus a capo prima del poro, ma nelle occasioni in cui non sono allineati, tendono a rimbalzare sul bordo del poro finché il movimento termico non li allinea per attraversarli. Però, quando la tensione era troppo alta, gli effetti termici sono stati soppressi e il virus si è attaccato alla membrana. Ciò suggerisce un punto debole nella tensione in cui è più probabile la traslocazione a testa in giù.

Niente di tutto questo è osservabile direttamente:il sistema è semplicemente troppo piccolo per essere visto in azione. Ma i ricercatori hanno potuto dedurre ciò che stava accadendo osservando lievi cambiamenti nella corrente attraverso i pori.

"Quando i virus mancano, sferragliano e vediamo questi piccoli dossi nella corrente, " disse Stein. "Quindi con questi piccoli urti, stiamo iniziando a farci un'idea di cosa sta facendo la molecola prima che scivoli via. Normalmente questi sensori sono ciechi a tutto ciò che sta succedendo fino a quando la molecola non scorre".

Sarebbe stato impossibile osservarlo usando il DNA. La morbidezza della molecola del DNA le consente di passare attraverso un poro in una configurazione piegata anche se non è allineata frontalmente. Ma poiché il virus è duro, non può piegarsi per passare. Ciò ha permesso ai ricercatori di isolare e osservare quelle dinamiche di contatto.

"Questi virus sono unici, "Stein ha detto. "Sono come piccoli parametri di valutazione perfetti."

Oltre a far luce sulla fisica di base, il lavoro potrebbe anche avere un'altra applicazione. Mentre il virus fd stesso è innocuo, i batteri che infetta, ad es. coli - non lo è. Sulla base di questo lavoro, potrebbe essere possibile costruire un dispositivo a nanopori per rilevare la presenza di fd, e per delega, e. coli. Altri virus pericolosi, tra cui Ebola e Marburg, condividono la stessa struttura a bastoncino di fd.

"Questo potrebbe essere un modo semplice per rilevare questi virus, " ha detto Tang. "Quindi questa è un'altra potenziale applicazione per questo".