(Phys.org) — Caricando qualsiasi proteina specifica e acido nucleico in una nanoparticella basata sul capside T4 del fago icosaedrico, i ligandi del veicolo di consegna cellulare risultante possono legarsi alla superficie di specifici tessuti bersaglio per fornire il carico di proteine/DNA. (Le nanoparticelle virali icosaedriche sono gusci proteici evolutivi assemblati in un ordine gerarchico che si traduce in uno strato proteico stabile e uno spazio interno per accogliere acidi nucleici e proteine; un capside è il guscio proteico di un virus.) La tecnica ha farmaci e geni- applicazioni di consegna nelle malattie umane, diagnostica e imaging cellulare, e altre aree mediche. Recentemente, scienziati dell'US Naval Research Laboratory, Washington, DC e University of Maryland a Baltimora hanno confezionato nanoparticelle T4 in vivo con ricombinazione ciclica attiva, o Cre, ricombinasi (un enzima di ricombinazione genetica utilizzato per manipolare la struttura del genoma e controllare l'espressione genica) e in vitro con DNA plasmidico di espressione mCherry fluorescente (una proteina fluorescente usata come marcatore quando etichettata con molecole e componenti cellulari), e ha consegnato queste nanoparticelle nelle cellule tumorali:quando rilasciate nelle cellule in presenza sia di DNA che di proteine, la ricombinasi migliora l'espressione di mCherry mediante circolarizzazione (cioè, cambiando il DNA lineare confezionato in un anello circolare). I ricercatori affermano che questo confezionamento efficiente e specifico nei capsidi e il disimballaggio sia del DNA che delle proteine ​​con il rilascio dei complessi proteina/DNA alterati enzimaticamente dalle nanoparticelle nelle cellule hanno un potenziale in numerose applicazioni a valle come la genetica e la terapia del cancro.

La dottoressa Jinny L. Liu ha discusso del documento che lei, Il prof. Lindsay W. Black e i loro coautori pubblicati su Atti della National Academy of Sciences USA . "Le nanoparticelle virali icosaedriche sono essenzialmente nanocontenitori da 100 nm per 80 nm che consentono di confezionare materiale genetico esogeno in vitro attraverso il macchinario dell'acido nucleico che generalmente consente solo il confezionamento di DNA/RNA lineare attraverso un canale portale, "Liu racconta Phys.org . "Però, in vitro il confezionamento delle proteine ​​è generalmente impossibile, perché per la maggior parte delle nanoparticelle virali non esistono macchinari per l'imballaggio delle proteine ​​paragonabili ai macchinari per l'imballaggio degli acidi nucleici." Mentre la proteina può essere reticolata chimicamente alla superficie interna del capside, questo dovrebbe portare alla denaturazione delle proteine ​​e alla perdita di attività enzimatica.

Detto ciò, la natura ha evoluto soluzioni a questo enigma del confezionamento delle proteine. Durante in vivo assemblaggio del capside virale, Liu spiega, alcuni virus batterici, o batteriofagi, proteine ​​bersaglio all'interno dei procapsidi prima l'acido nucleico è confezionato in modo da espellere le proteine ​​con l'acido nucleico, facilitando così l'infezione in combinazione con l'acido nucleico. (Un procapside, o prohead, è una struttura capside virale immatura formata nelle prime fasi dell'autoassemblaggio di alcuni batteriofagi. La produzione e l'assemblaggio di proheads stabili è un precursore essenziale per l'imballaggio del genoma dei batteriofagi. Solo pochi fagi sono ben caratterizzati in vivo sistemi di confezionamento di proteine, e il fago T4 è il più caratterizzato. "Il laboratorio del Prof. Black all'UMB e il mio laboratorio all'NRL hanno dimostrato che non solo uno specifico enzima estraneo - la ricombinasi ciclica (Cre) ricombinasi - può essere confezionato nel capside in vivo , ma anche che è attivo all'interno del capside." Questa attività è stata dimostrata mostrando la religazione (la ricongiunzione di due filamenti di DNA o altre molecole mediante un legame di estere fosfato) di DNA lineare confezionato fiancheggiato da due siti di ricombinazione Cre.

L'articolo mostra che lo spazio sostanziale all'interno di un nanocontenitore T4 ospita l'enzima Cre attivo insieme al DNA esogeno. "Per potenziali applicazioni, T4 può confezionare fino a 50 kb di DNA lineare esogeno contenente geni desiderati a lunghezza intera insieme a ricombinasi, proteine ​​Cre o -rosse, per la ricombinazione omologa specifica all'interno del cromosoma, "Liu note. ( Ricombinazione omologa è un tipo di ricombinazione genetica in cui le sequenze nucleotidiche vengono scambiate tra due molecole di DNA simili o identiche.) "Ci aspettiamo che l'enzima cas9 possa essere incapsidato in modo comparabile - e infatti, almeno otto diverse proteine ​​sono state incapsulate in questo modo. Attraverso la ricombinazione omologa, il nostro sistema può consentire al gene corretto di sostituire il gene mutato nella sua posizione originale all'interno del cromosoma o eliminando con precisione i geni iperattivi nelle cellule staminali." Liu sottolinea che il vettore di consegna T4 è più sicuro e meglio controllato di altri geni di consegna virale terapia, come quelli che forniscono geni utilizzando vettori virali animali infettivi per inserire casualmente il gene all'interno del cromosoma.

Nella loro carta, gli autori riferiscono che l'espressione genica del capside T4 NP e il sistema di rilascio delle proteine ​​possono essere complementari o utilizzati in combinazione con la terapia genica basata su RNA Cas e taran nucleasi. (I geni Cas codificano per proteine ​​correlate a loci del DNA contenenti brevi ripetizioni di sequenze di basi note come ripetizioni palindromiche brevi raggruppate regolarmente interspaziate, o CRISPR.) "Il sistema di espressione delle nanoparticelle T4 può facilmente integrare Cas9 e la ricombinazione basata sulla taran nucleasi impacchettando il cas9 lineare, DNA plasmidico bersaglio-sgRNA, e Cre ricombinasi – o anche ligasi, un enzima che facilita l'unione dei filamenti di DNA e fornisce le nanoparticelle T4 risultanti nelle cellule eucariotiche riceventi con elevata specificità che impiegano SOC e HOC, "Liu racconta Phys.org . (SOC e HOC sono proteine ​​del capside T4 superflue.) "Mostrando i ligandi mirati (molecole di legame) sulla superficie, l'espressione genica del capside T4 e il sistema proteico saranno in grado di veicolare in modo efficiente i plasmidi Cas9 e sgRNA insieme nelle cellule riceventi desiderate. Proteine ​​enzimaticamente attive rilevanti Cas9, esonucleasi lambda, la proteina lambda beta e altre possono essere consegnate direttamente contemporaneamente dalla nanoparticella T4".

Liu aggiunge che il suo laboratorio ha anche studiato l'imaging cellulare e la somministrazione di farmaci/geni alle cellule eucariotiche utilizzando nanoparticelle senza coda di T4, che i ricercatori hanno dimostrato possono entrare nelle cellule eucariotiche senza causare la morte cellulare.

Un esempio specifico di potenziali applicazioni terapeutiche genetiche e farmacologiche a valle risultanti dal nuovo approccio è la consegna della proteina tossica e del plasmide lineare che produce peptidi o anticorpi neutralizzanti in cellule tumorali mirate che mostrano marcatori tumorali specifici utilizzando proteine ​​​​leganti marcatori SOC + HOC ad alta affinità sul superficie dei capsidi, mentre un altro esempio è quello di utilizzare il sistema per la terapia genica dell'HIV.

Liu aggiunge che esistono diversi percorsi per utilizzare questo sistema per la terapia genica:

• Fornitura di nanoparticelle T4 confezionate con ricombinasi (o ligasi) e DNA plasmidico lineare per produrre gp120 o interferone per generare o potenziare la risposta immunitaria nei pazienti
• Fornitura di nanoparticelle T4 confezionate con ricombinasi (ligasi) e DNA plasmidico di espressione CD40 solubile lineare in linfociti T o cellule ematopoietiche per bloccare l'infezione dell'HIV-1
• Inibendo l'RNA fornendo il DNA plasmidico ingegnerizzato che può produrre RNA esca per legare il DNA sensoriale virale
• Inibizione della proteina mediante la somministrazione di anticorpi antivirali confezionati e DNA plasmidico di anticorpi anti-HIV

Oltre alla diagnostica e all'imaging cellulare, il sistema gene-proteina delle nanoparticelle T4 può fornire geni riparati per correggere le malattie genetiche umane, ad esempio invertire il deficit di adenosina deaminasi (ADA) introducendo il complesso proteina-DNA per esprimere ADA nelle cellule staminali. Altre vaste aree di ricerca influenzate dalle tecnologie di terapia genica, come difetti genetici, cancro, malattie neurologiche negli adulti, e l'invecchiamento stesso, possono anche beneficiare di questo studio.

Andando avanti, gli scienziati vogliono sviluppare più procapsidi T4 che impaccano l'esonucleasi e altre ricombinasi insieme al DNA bersaglio ingegnerizzato per dimostrare che i capsidi T4 risultanti possono inserire il gene in una linea di cellule staminali con una deficienza genetica. "Inoltre, "Liu conclude, "stiamo lavorando per adattare il nostro sistema per fornire peptidi terapeutici o anticorpi alle cellule esposte o infettate da agenti di minaccia biologica, come tossine proteiche o virus, neutralizzazione efficiente degli effetti delle tossine. Il trattamento e la cura di cellule e tessuti esposti a tali agenti sono di grande interesse per la nostra comunità di ricerca sulla biodifesa".

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