I ricercatori hanno sviluppato una nuova tecnica di imaging del DNA avanzata in grado di sondare la struttura dei singoli filamenti di DNA su scala nanometrica. Poiché il DNA è alla base di molti processi patologici, la tecnica potrebbe aiutare gli scienziati a ottenere importanti informazioni su cosa va storto quando il DNA viene danneggiato o quando altri processi cellulari influenzano l'espressione genica.

Il nuovo metodo di imaging si basa su una tecnica chiamata microscopia a singola molecola aggiungendo informazioni sull'orientamento e il movimento dei coloranti fluorescenti attaccati al filamento di DNA.

W.E. Moerner, Università di Stanford, STATI UNITI D'AMERICA, è il fondatore della spettroscopia a singola molecola, un metodo rivoluzionario del 1989 che ha permesso agli scienziati di visualizzare per la prima volta singole molecole con la microscopia ottica. Dei Premi Nobel 2014 per la microscopia ottica oltre il limite di diffrazione (Moerner, Inferno e Betzig), Moerner e Betzig hanno utilizzato singole molecole per visualizzare una fitta serie di molecole in momenti diversi.

Nella rivista The Optical Society per la ricerca ad alto impatto, ottica , il team di ricerca guidato da Moerner descrive la loro nuova tecnica e la dimostra ottenendo immagini a super risoluzione e misurazioni di orientamento per migliaia di singole molecole di colorante fluorescente attaccate a filamenti di DNA.

"Si può pensare a queste nuove misurazioni come a piccole frecce a doppia punta che mostrano l'orientamento delle molecole attaccate lungo il filamento di DNA, " ha detto Moerner. "Queste informazioni di orientamento riportano sulla struttura locale delle basi del DNA perché vincolano la molecola. Se non avessimo queste informazioni sull'orientamento, l'immagine sarebbe solo un punto".

Aggiunta di ulteriori informazioni su scala nanometrica

Un filamento di DNA è molto lungo, ma stringa stretta, solo pochi nanometri di diametro. Microscopia a singola molecola, insieme a coloranti fluorescenti che si attaccano al DNA, può essere utilizzato per visualizzare meglio questa piccola stringa. Fino ad ora, era difficile capire come fossero orientati quei coloranti e impossibile sapere se il colorante fluorescente fosse attaccato al DNA in modo rigido o un po' lasco.

Adam S. Backer, primo autore del saggio, sviluppato un modo abbastanza semplice per ottenere l'orientamento e la dinamica rotazionale da migliaia di singole molecole in parallelo. "La nostra nuova tecnica di imaging esamina come ogni singola molecola di colorante che etichetta il DNA è allineata rispetto alla struttura molto più grande del DNA, "ha detto Backer. "Stiamo anche misurando quanto sia traballante ciascuna di queste molecole, che può dirci se questa molecola è bloccata in un particolare allineamento o se si muove nel corso della nostra sequenza di misurazione".

La nuova tecnica offre informazioni più dettagliate rispetto ai cosiddetti metodi di "insieme" odierni, che media gli orientamenti per un gruppo di molecole, ed è molto più veloce delle tecniche di microscopia confocale, che analizzano una molecola alla volta. Il nuovo metodo può essere utilizzato anche per molecole relativamente deboli.

Poiché la tecnica fornisce informazioni su scala nanometrica sul DNA stesso, potrebbe essere utile per monitorare i cambiamenti di conformazione del DNA o il danneggiamento di una particolare regione del DNA, che si presenterebbero come cambiamenti nell'orientamento delle molecole di colorante. Potrebbe anche essere usato per monitorare le interazioni tra DNA e proteine, che guidano molti processi cellulari.

30, 000 orientamenti di singole molecole

I ricercatori hanno testato la tecnica di imaging del DNA avanzata utilizzandola per analizzare un colorante intercalante; un tipo di colorante fluorescente che scorre nelle aree tra le basi del DNA. In un tipico esperimento di imaging, ne acquisiscono fino a 300, 000 posizioni di singole molecole e 30, 000 misurazioni dell'orientamento di singole molecole in poco più di 13 minuti. L'analisi ha mostrato che le singole molecole di colorante erano orientate perpendicolarmente all'asse del filamento di DNA e che mentre le molecole tendevano ad orientarsi in questa direzione perpendicolare, si muovevano anche all'interno di un cono vincolato.

I ricercatori hanno poi eseguito un'analisi simile utilizzando un diverso tipo di colorante fluorescente che consiste di due parti:una parte che si attacca al lato del DNA e una parte fluorescente che è collegata tramite un laccio floscio. La tecnica di imaging del DNA avanzata ha rilevato questa instabilità, dimostrando che il metodo potrebbe essere utile per aiutare gli scienziati a capire, molecola per molecola, se etichette diverse si attaccano al DNA in modo mobile o fisso.

Nella carta, i ricercatori hanno dimostrato una risoluzione spaziale di circa 25 nanometri e misurazioni dell'orientamento di singole molecole con una precisione di circa 5 gradi. Hanno anche misurato la dinamica rotazionale, o mollezza, di singole molecole con una precisione di circa 20 gradi.

Come funziona

Per acquisire informazioni sull'orientamento di singole molecole, i ricercatori hanno utilizzato una tecnica ben studiata che aggiunge un elemento ottico chiamato modulatore elettro-ottico al microscopio a singola molecola. Per ogni fotogramma della fotocamera, questo dispositivo ha cambiato la polarizzazione della luce laser utilizzata per illuminare tutti i coloranti fluorescenti.

Since fluorescent dye molecules with orientations most closely aligned with the laser light's polarization will appear brightest, measuring the brightness of each molecule in each camera frame allowed the researchers to quantify orientation and rotational dynamics on a molecule-by-molecule basis. Molecules that switched between bright and dark in sequential frames were rigidly constrained at a particular orientation while those that appeared bright for sequential frames were not rigidly holding their orientation.

"If someone has a single-molecule microscope, they can perform our technique pretty easily by adding the electro-optic modulator, " said Backer. "We've used fairly standard tools in a slightly different way and analyzed the data in a new way to gain additional biological and physical insight."