Gli scienziati hanno progettato e sintetizzato catene di molecole con una sequenza e una lunghezza precise per proteggere efficacemente le nanostrutture di DNA 3-D dalla degradazione strutturale in una varietà di condizioni rilevanti dal punto di vista biomedico. Hanno dimostrato come questi "origami di DNA rivestiti di peptoidi" abbiano il potenziale per essere utilizzati per la somministrazione di farmaci e proteine ​​antitumorali, molecole biologiche di imaging, e mirare ai recettori della superficie cellulare implicati nel cancro. Il loro metodo per la progettazione di peptoidi per stabilizzare gli origami del DNA in ambienti fisiologici è descritto in un articolo pubblicato su Atti dell'Accademia Nazionale delle Scienze la settimana del 9 marzo.

Simile all'arte giapponese di piegare la carta, L'origami del DNA è il ripiegamento di lunghi, catene di DNA flessibili nelle forme desiderate su scala nanometrica (miliardesimi di metro) "pinzando" diverse parti della catena con le coppie di basi complementari di brevi filamenti di DNA. Queste architetture su nanoscala programmabili e controllate con precisione potrebbero essere utili per molte applicazioni biomediche, compresa la consegna mirata di farmaci e geni ai tessuti o alle cellule desiderati, imaging dei processi biologici all'interno del corpo, e biorilevamento per il rilevamento delle malattie o il monitoraggio della salute. Però, l'abilitazione di tali applicazioni richiederà soluzioni per proteggere le strutture origami del DNA in fluidi biologici complessi e abilitare nuove funzioni che non sono inerenti al DNA.

"Uno dei fattori limitanti nell'applicazione dei benefici della struttura e della forma degli origami del DNA alla nanomedicina è che, posto all'interno del corpo umano, la nanostruttura del DNA sarebbe facilmente digerita dagli enzimi o degradata in risposta ai cambiamenti nella composizione della soluzione o nel livello di pH, " ha spiegato il primo autore Shih-Ting (Christine) Wang, un postdoc nel Soft and Bio Nanomaterials Group del Center for Functional Nanomaterials (CFN) presso il Brookhaven National Laboratory del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti (DOE). "In questa ricerca, abbiamo sintetizzato molecole biocompatibili chiamate peptoidi con una composizione e una lunghezza di sequenza molecolare ben definite. Abbiamo rivestito con questi peptoidi un origami di DNA di forma ottaedrica, che ha un'elevata stabilità meccanica e un ampio spazio aperto per trasportare carichi su scala nanometrica come farmaci antitumorali a piccole molecole. Le nostre dimostrazioni hanno dimostrato che i rivestimenti peptoidi proteggevano efficacemente l'origami del DNA in varie condizioni fisiologiche e supportavano l'aggiunta di diverse funzionalità chimiche per applicazioni biomediche".

I peptoidi assomigliano ai peptidi, o corte catene di amminoacidi. Però, nei peptoidi, le catene laterali (gruppi chimici attaccati alla catena principale o alla spina dorsale della molecola) sono attaccate all'azoto piuttosto che al carbonio. Inoltre, i peptoidi sono più flessibili, a causa della mancanza di legami idrogeno nella spina dorsale. Questa flessibilità può essere sfruttata per controllare come i peptoidi si legano all'origami del DNA.

"Il nostro obiettivo era realizzare un rivestimento minimalista che non aggiungesse volume all'origami ma allo stesso tempo fosse abbastanza efficiente da offrire protezione, solubilità, e compatibilità con diverse biofunzioni, " ha detto l'autore corrispondente Oleg Gang, leader del CFN Soft and Bio Nanomaterials Group e professore di ingegneria chimica e di fisica applicata e scienza dei materiali alla Columbia Engineering. "Se l'origami rivestito diventa ingombrante, la sua forma e il modo in cui interagisce e si adatta ad altre biomolecole e gli origami ne sarebbero influenzati, introducendo una serie di complicazioni”.

Wang e Gang, assistito da un collaboratore dell'Imperial College di Londra, ha utilizzato le strutture della Molecular Foundry (MF) del Lawrence Berkeley National Laboratory per sintetizzare due tipi di architetture peptoidi per la protezione degli origami del DNA:il tipo a pennello e il tipo a blocco. Entrambe le architetture hanno un dominio di legame al DNA (parte caricata positivamente che si lega al DNA caricato negativamente) e un dominio solubile in acqua (parte che assicura che il DNA sia circondato da molecole d'acqua, necessari per la stabilizzazione). L'architettura di tipo brush alterna questi due domini, mentre l'architettura a blocchi li raggruppa per formare "blocchi" distinti.

Per determinare quale tipo era migliore nel fornire protezione, gli scienziati hanno studiato il legame tra DNA a due filamenti (duplex) e peptoidi. Esperimenti con colorante fluorescente (che si lega al DNA) hanno mostrato che una specifica architettura a spazzola era più efficiente nello stabilizzare il DNA duplex rivestito con peptoidi ad alta temperatura. Un collaboratore della RMIT University in Australia ha simulato le interazioni DNA-peptoide a livello molecolare per capirne il motivo.

"Crediamo che la struttura alternata raggiunga un equilibrio, in quanto alcuni pezzi si trovano all'interno del solco della struttura a doppia elica del DNA per conferire protezione, mentre altri pezzi sporgono per interagire favorevolmente con l'acqua, " ha detto Wang. "Una configurazione ottimale è il tipo di pennello con 12 gruppi che legano il DNA e 12 gruppi solubili in acqua".

Guidati da questi studi, il team ha studiato la stabilità strutturale dell'origami di DNA rivestito di peptoide in diversi tipi di condizioni fisiologicamente rilevanti:in una soluzione contenente una bassa concentrazione di ioni di magnesio (Mg) caricati positivamente, in una soluzione contenente una nucleasi DNA-specifica (tipo di enzima), e incubate in terreni di coltura cellulare (contenenti sia nucleasi che ioni Mg a bassa concentrazione). Tipicamente, è necessaria un'elevata concentrazione di ioni Mg per stabilizzare l'origami del DNA riducendo la repulsione delle cariche negative del DNA-DNA, ma i fluidi fisiologici contengono concentrazioni molto più basse.

Per le loro indagini, hanno usato una combinazione di tecniche sperimentali:elettroforesi su gel di agarosio, un metodo per separare frammenti di DNA (o altre macromolecole) in base alla loro carica e dimensione; imaging al microscopio elettronico a trasmissione e diffusione dinamica della luce al CFN; e diffusione di raggi X a piccolo angolo in tempo reale presso la linea di luce Life Science X-ray Scattering (LiX) della National Synchrotron Light Source II (NSLS-II) di Brookhaven. I risultati hanno indicato che la struttura dell'origami era rimasta intatta dopo essere stata rivestita con peptoidi appositamente progettati e collocata nelle diverse condizioni fisiologiche.

A seguito di questi esperimenti, gli scienziati hanno condotto una serie di dimostrazioni in collaborazione con il gruppo Bertozzi della Stanford University per esplorare come l'origami rivestito di peptoide potrebbe essere utilizzato in applicazioni biomediche. Per esempio, hanno caricato il farmaco chemioterapico doxorubicina nell'origami rivestito. La doxorubicina è uno dei farmaci comunemente somministrati alle pazienti con carcinoma mammario HER2-positivo, in cui una sovraespressione della proteina HER2 (un recettore sulle cellule del seno) fa sì che le cellule si dividano e crescano in modo incontrollato. Oltre 48 ore, l'origami rivestito rilasciava meno doxorubicina rispetto alla sua controparte non rivestita, misurata attraverso l'intensità della fluorescenza intrinseca del farmaco.

"L'obiettivo finale è essere in grado di modulare la velocità di rilascio durante il processo di somministrazione del farmaco per controllare gli effetti biologici e tossici, " ha spiegato Wang.

In una seconda dimostrazione di nanocargo, hanno studiato se le proteine ​​potessero essere consegnate in un modo simile. Hanno incapsulato una proteina derivata dalla mucca (attaccata a molecole fluorescenti per la visualizzazione) all'interno dell'origami rivestito in presenza dell'enzima che digerisce le proteine ​​tripsina. La digestione di questa proteina incapsulata da parte della tripsina è stata ridotta e rallentata a causa di una combinazione dell'origami del DNA stesso e del rivestimento peptoide.

In una dimostrazione finale, hanno funzionalizzato la superficie dell'origami di DNA rivestito con peptoide con trastuzumab. Più comunemente conosciuto con il marchio Herceptin, trastuzumab è un anticorpo che prende di mira i recettori HER2. Legandosi a questi recettori, trastuzumab impedisce alle cellule tumorali di ricevere i segnali chimici di cui hanno bisogno per crescere. Hanno ottenuto la funzionalizzazione della superficie aggiungendo gruppi chimici a siti specifici sulla molecola di trastuzumab e nelle sequenze peptoidi. Attraverso "click chimica, " questi gruppi reagiscono selettivamente per formare legami covalenti (simili a fare clic sulla fibbia di una cintura di sicurezza).

Negli esperimenti successivi, Wang intende esplorare il potenziale della terapia combinatoria, in cui un origami di DNA rivestito di peptoide contenente doxorubicina e dotato di una superficie funzionalizzata con trastuzumab prende di mira le cellule del cancro al seno HER2-positive.

Wang ha ricevuto un finanziamento tramite il programma di maturazione della tecnologia di Brookhaven per sviluppare ulteriormente questa tecnologia sulla base di un passo che ha sviluppato come partecipante al secondo seminario di formazione sull'imprenditorialità ospitato dall'ufficio di trasferimento tecnologico di Brookhaven nell'aprile 2019. Il gruppo legale sulla proprietà intellettuale di Brookhaven ha recentemente presentato un domanda di brevetto provvisoria per la metodologia di progettazione peptoide all'Ufficio brevetti e marchi degli Stati Uniti.

"Stiamo entrando nella fase di traduzione, condurre esperimenti utilizzando cellule e potenzialmente interi organismi, " ha detto Gang.