In alto:Riepilogo della nuova tecnologia. A sinistra:progetto del microchip e della parete scorrevole per la preconcentrazione del DNA. A destra:immagine del microchip e della parete scorrevole per esperimenti di compartimentazione. Sono stati aggiunti coloranti blu e gialli per la visualizzazione. Credito:Microsistemi e nanoingegneria, doi:10.1038/s41378-019-0125-7
Un team di ricerca ha recentemente sviluppato "pareti scorrevoli" come nuova tecnica per il controllo dei fluidi nei dispositivi microfluidici, permettendo alle pareti semirigide o rigide di scorrere all'interno di un chip microfluidico. In un nuovo rapporto ora su Natura:microsistemi e nanoingegneria , Bastien Venzac e un team di scienziati dell'Istituto Curie e dell'Università Sorbona di Parigi, Francia, progettato diverse funzioni fluidiche utilizzando la geometria della parete scorrevole. Il dispositivo conteneva valvole di commutazione on/off per bloccare o riconfigurare i canali a seconda della geometria della parete. La configurazione conteneva una membrana a base di idrogel per concentrare, purificare e trasportare le biomolecole da un canale all'altro. La tecnica è compatibile con i metodi di litografia morbida per una facile implementazione basata su flussi di lavoro di fabbricazione tipici su chip di polidimetilsilossano (PDMS). Il nuovo metodo apre la strada a una varietà di applicazioni microfluidica, formando semplice, dispositivi manuali per applicazioni point-of-care nei laboratori biologici.
I sistemi veramente riconfigurabili sono il sogno di ogni ingegnere di microfluidica, dove il rimodellamento descrive sistemi intelligenti costruiti in unità modulari e assemblati per una rapida riorganizzazione tra gli esperimenti. Per la maggior parte dei sistemi microfluidici, però, la rete di canali rimane fissa durante la microfabbricazione e non può essere ristrutturata su misura durante l'esperimento. Gli ingegneri sono anche in grado di effettuare modifiche solo nel pompaggio, valvolare o utilizzare forze esterne di elettricità e campi magnetici. Per soddisfare i limiti o le sfide esistenti della produzione microfluidica, Venzac et al. ha proposto un nuovo concetto di attuazione microfluidica noto come "pareti scorrevoli". Il metodo è compatibile con la fabbricazione di litografia morbida ma non richiede apparecchiature esterne. Può essere azionato manualmente e può essere incluso in un singolo componente del dispositivo.
Venzac et al. ha sviluppato pareti scorrevoli utilizzando diversi metodi di produzione per ingegnerizzarle all'interno di canali aperti di chip di polidimetilsilossano (PDMS). Il processo di attuazione ha permesso loro di aprire o chiudere in modo reversibile un canale che pompa fluidi, quindi riorientare i flussi per riconfigurare a piacimento una rete microfluidica. Il team ha descritto il principio del metodo e ha dimostrato funzioni semplici, inclusa la formazione di una lastra di idrogel per adattarsi a quattro dimensioni (4-D), coltura cellulare controllata, seguita da preconcentrazione elettrocinetica del DNA su membrana in compartimenti microfluidici. Hanno implementato la tecnologia a basso costo per la prototipazione rapida e hanno controllato manualmente le pareti scorrevoli per semplicità, il team potrebbe anche automatizzare completamente le pareti utilizzando motori o attuatori controllati da computer. La nuova cassetta degli attrezzi è ben adattata per applicazioni con dimensioni del canale microfluidico superiori a 100 µm e richiede solo pochi elementi di attuazione.
Principio della parete scorrevole. Le strutture PDMS contengono un canale guida e un canale fluidico e sono state legate a una superficie planare PDMS. In questo esempio, una parete scorrevole con un canale inciso è stata inserita dopo la fabbricazione del chip all'interno del canale di guida. Il canale fluidico era a bloccato o b libero. I dettagli dell'intersezione parete scorrevole/canale del fluido sono forniti negli inserti. Credito:Microsistemi e nanoingegneria, doi:10.1038/s41378-019-0125-7
Per il principio generale di progettazione, i ricercatori hanno inserito una struttura rigida/semirigida in un canale guida nel chip microfluidico PDMS e hanno utilizzato una varietà di materiali per sviluppare pareti scorrevoli tra cui (1) pellicole in acciaio inossidabile, (2) fotopolimerizzabile resist fotopolimerizzato in stampi PDMS, e (3) resina fotopolimerizzabile stampata mediante stampa 3D stereolitografica. Hanno selezionato le tecniche ingegneristiche per adattare l'esperimento in base alle loro proprietà intrinseche e hanno impedito l'instabilità o la rottura della parete durante l'attuazione controllando la rigidità del materiale, preferendo l'acciaio inossidabile per la maggior parte delle pareti scorrevoli sottili. Per le pareti scorrevoli più grandi hanno utilizzato la stereolitografia convenzionale e hanno utilizzato la microfresatura su acciaio inossidabile per includere piccole caratteristiche su una parete scorrevole.
Come primo proof of concept, Venzac et al. predisposto due tipi di valvole:una valvola on/off e una valvola deviatrice metallica con un ingresso e due uscite. Le valvole scorrevoli sono principalmente interessanti per la loro praticità nei dispositivi organ-on-chip e nei costrutti di colture cellulari. I ricercatori hanno anche mostrato l'uso di pareti scorrevoli come siringhe su chip per pompare manualmente i fluidi e non hanno osservato perdite di liquido durante la spinta o l'aspirazione dell'aria negli esperimenti. Le pareti scorrevoli erano ingegnose per la costruzione di grandi camere:il team ha aggiunto due strette scanalature sul tetto e sul pavimento della camera per guidare una parete scorrevole verticale in acciaio inossidabile e regolare la comunicazione tra i compartimenti.
IN ALTO:Esperimenti sulle valvole. a Progettazione del chip e della parete scorrevole basata su resist fotoinduribile per l'esperimento della valvola on-off. b Progettazione del chip e della parete metallica scorrevole per l'esperimento della valvola di commutazione. c Massima pressione sopportata da pareti a base resist (serie gialla) ea base metallica (serie grigia) per diversi rapporti tra altezza e larghezza canale guida e parete scorrevole (tre esperimenti per condizione). d Immagine fluorescente della valvola di commutazione con acqua carica di fluoresceina che scorre attraverso il percorso aperto (13 µl/s). BOTTOM:Esperimento di pompaggio. un design del chip, b Immagini sequenziali del pompaggio di acqua carica di fluoresceina attraverso camere da 1µl. La posizione del pistone è indicata con linee rosse tratteggiate. c Spostamento del liquido rispetto allo spostamento del pistone assoluto (l'origine del pistone è stata impostata all'inizio del riempimento della prima camera), per spingere (blu) poi tirare (rosso), media su quattro diversi dispositivi. Credito:Microsistemi e nanoingegneria, doi:10.1038/s41378-019-0125-7
Il team ha infine condotto test di biofunzionalizzazione utilizzando il nuovo dispositivo e ha osservato la coltura cellulare 4-D e la migrazione cellulare. In questo esperimento, hanno caricato una soluzione di collagene fluorescente nella metà destra della camera, riempite la seconda metà con tampone e mescolate i due per creare una lastra di idrogel. Tali idrogel sono un requisito importante per sviluppare compartimenti organo su chip 3D. Per testare la loro funzione biologica, Venzac et al. ha studiato la migrazione cellulare con cellule dendritiche (cellule immunitarie) caricate nella soluzione di collagene all'interno di una camera. Il team ha riempito il secondo compartimento con una soluzione di chemochine e ha rimosso la parete scorrevole in acciaio inossidabile per creare un'interfaccia diritta che consente al chemiotattico di diffondersi sulla lastra di collagene per consentire alle cellule dendritiche di migrare sull'interfaccia gel/soluzione, formare una coltura cellulare 4-D.
Esperimenti di compartimentazione. (a) Progettazione del chip e della parete scorrevole metallica. (b) Immagini viste dall'alto di un test di tenuta. A sinistra:immagine luminosa della camera. A destra:immagine fluorescente della camera dopo 8 h. (c) Gradiente di fluoresceina nel vano tampone Tris-EDTA dopo il posizionamento di un foro di 200 µm nella parete scorrevole all'interno della camera. I limiti del muro scorrevole e del foro sono indicati con le linee tratteggiate. Le linee di colore corrispondono alla superficie dell'immagine con un'intensità superiore al 12% del valore massimo (bianco:1 s, rosso:4 s, giallo:9 s, verde:14 s, ciano:anni '50, blu:110 s, magenta:170 s dopo lo spostamento della parete). (d) Vista dall'alto, immagine confocale codificata in profondità di una lampada fluorescente, lastra di collagene gelificato a destra, metà fondo della camera dopo la rimozione della parete scorrevole. (e) Le traiettorie delle cellule dendritiche all'interno della lastra di collagene prima della rimozione della parete scorrevole (0-30 min) e dopo la rimozione della parete scorrevole (30-240 min) si sono decomposte in due periodi. Il primo non ha mostrato migrazione preferenziale (30–120 min), mentre le cellule sono attratte dal compartimento delle chemochine da 120 a 240 min. Gli assi sono in micrometri, e l'asse verticale punta lontano dal compartimento delle chemochine. Credito:Microsistemi e nanoingegneria, doi:10.1038/s41378-019-0125-7
Hanno anche preconcentrato elettrocineticamente macromolecole di DNA, controllavano il loro trasporto e rilascio nella nuova configurazione. Per realizzare questo, il team ha utilizzato una membrana idrogel mobile e riconfigurabile nei sistemi microfluidici e ha progettato una parete scorrevole con una finestra integrata utilizzando la stampa 3D ad alta risoluzione. Hanno applicato un campo elettrico costante nei canali per consentire la migrazione elettroforetica del DNA marcato con un tag fluorescente in una soluzione tampone. La dimensione dei pori dell'idrogel ha impedito la migrazione del DNA, inducendoli a preconcentrarsi sulla membrana. Gli scienziati hanno indotto il libero flusso di DNA preconcentrato nella configurazione, per trasportare campioni da un canale all'altro, come un nuovo e semplice percorso per la preparazione e l'analisi del campione.
Esperimento di preconcentrazione e purificazione del DNA. (a) Progettazione del chip e della parete scorrevole. Una membrana PEGDA (rosa) è stata fotopolimerizzata nella finestra di una parete scorrevole. Le frecce colorate indicano la posizione delle seguenti immagini con il bordo colorato corrispondente. (b) Preconcentrazione mediante elettroforesi di 100 pg di Lambda-DNA contro la membrana PEGDA in una parete scorrevole stampata in 3D. (c) Evoluzione nel tempo del valore medio di grigio all'interno del rettangolo giallo di b). (d) Immagini fluorescenti del DNA durante la preconcentrazione contro la membrana PEGDA, (e) dopo lo spostamento al secondo canale e (f) rilascio elettroforetico. Barre di scala:250 µm. Le direzioni di migrazione o spostamento del DNA sono indicate dalle frecce gialle. Credito:Microsistemi e nanoingegneria, doi:10.1038/s41378-019-0125-7
In questo modo, Bastien Venzac e colleghi hanno sviluppato una nuova cassetta degli attrezzi per innovare l'uso della microfluidica convenzionale. Le pareti scorrevoli avevano caratteristiche aggiuntive come microcanali o finestre con gel caricati e soluzioni per potenziali applicazioni oltre a quelle delle convenzionali valvole in-chip. In particolare, hanno ottenuto la coltura cellulare 4-D e la preconcentrazione del DNA utilizzando la configurazione a parete scorrevole singola. Gli scienziati prevedono la tecnica in ampie applicazioni per ambienti biomedici a basso costo ea bassa tecnologia.
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