Attualmente è difficile osservare direttamente la formazione di nanostrutture intracellulari in laboratorio. In un nuovo rapporto, Miaomiao Zhang e un gruppo di ricerca in chimica, Scienze di vita, ingegneria medica e scienza e tecnologia, in Cina, utilizzato una piccola molecola razionalmente progettata abbreviata NBC-Iod-CBT (abbreviazione di 4-nitrobenzil carbammato–Cys(SEt)-Asp-Asp-Phe(iodio)–2-ciano-benzotiazolo) e la formazione di nanoparticelle intracellulari osservata direttamente con la tomografia computerizzata ( nano-TC).

Durante gli esperimenti, i meccanismi di riduzione del glutatione (GSH) e di scissione della nitroreduttasi (NTR) hanno fatto sì che le molecole NBC-Iod-CBT subissero una reazione di condensazione click e nanoparticelle (NP) autoassemblanti come Iod-CBT-NP. Quando il team ha condotto l'imaging nano-TC di NBC-Iod-CBT trattati, cellule HeLa che esprimono nitroreduttasi in laboratorio, hanno mostrato l'esistenza di Iod-CBT-NP autoassemblati nel loro citoplasma. La nuova strategia è ora pubblicata su Progressi scientifici e aiuterà gli scienziati della vita ei bioingegneri a comprendere i meccanismi di formazione delle nanostrutture intracellulari.

Una strategia intelligente per il nanoassemblaggio

L'assemblaggio di nanostrutture utilizzando piccoli precursori molecolari all'interno delle cellule è una strategia intelligente con grandi vantaggi nell'imaging molecolare e nella somministrazione di farmaci. Piccole molecole possono essere assorbite facilmente dalle cellule, ma vengono anche eliminati velocemente. In contrasto, le nanostrutture con agenti terapeutici hanno tempi di ritenzione più lunghi nelle cellule con maggiore potenza. Tuttavia, è molto più difficile per una cellula assumere una nanostruttura rispetto a una piccola molecola. Gli scienziati quindi attivano le nanostrutture per l'assorbimento cellulare modificando la superficie cellulare con "testate" di mira, ' ma tali modifiche possono ridurre la riproducibilità del nanocomplesso. Di conseguenza, un metodo intelligente di recente sviluppo mira a formare nanoparticelle intracellulari, dove le colture cellulari incubate con un piccolo precursore molecolare avranno una nanostruttura al loro interno, per interessanti applicazioni nell'imaging molecolare e nella somministrazione di farmaci. Però, è ancora difficile distinguere tra le nanostrutture formate artificialmente dalle strutture cellulari intrinseche. Per realizzare questo, Zhang et al. ha progettato per la prima volta un precursore di piccole molecole contenente iodio (iod), hanno quindi sottoposto il composto all'autoassemblaggio intracellulare guidato da enzimi per formare le nanoparticelle di interesse e hanno utilizzato la nano-TC (tomografia computerizzata) per osservare le nanoparticelle intracellulari.

La piccola struttura molecolare iodurata NBC-Iod-CBT aveva un design razionale costituito da quattro parti, che comprendeva

1. Un substrato di 4-nitrobenxil carbammato (NBC) per la scomposizione della nitroreduttasi (NTR),
2. Un motivo latente di cisteina (Cys) e strutture di 2-ciano-benzotiazolo (CBT) per reazioni di condensazione click CBT-Cys,
3. Una regione iodata per il miglioramento del contrasto della tomografia computerizzata, e
4. Due motivi di acido aspartico idrofilo per una buona solubilità in acqua in condizioni fisiologiche

Quando il composto è entrato in cellule cancerose ipossiche (private di adeguati livelli di ossigeno) che sovraesprimono la nitroreduttasi (NTR), hanno subito l'autoassemblaggio per formare nanoparticelle (NP) note come Iod-CBT-NP. Per indurre la formazione di nanoparticelle innescata dalla nitroreduttasi (NTR) in laboratorio, gli scienziati hanno incubato la piccola molecola NBC-Iod-CBT con soluzioni saline tamponate e hanno aggiunto la soluzione di nitroreduttasi per due ore per formare nanostrutture con assorbanze visibili tra 500-700 nm.

Quando Zhang et al. aggiunto alla soluzione un inibitore della nitroreduttasi noto come dicumarina, le assorbanze visibili delle miscele sono diminuite, confermando la formazione di nanostrutture in presenza di nitroreduttasi. Utilizzando immagini di microscopia elettronica a trasmissione, il team ha osservato la comparsa di nanoparticelle e ha utilizzato la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e la spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice ad alta risoluzione per confermare la formazione di Iod-CBT-NP. Zhang et al. successivamente utilizzato immagini nano-CT tridimensionali (3-D) della miscela con una microscopia a raggi X morbidi nano-CT per ricostruire infine le immagini nano-CT 3-D, dove diversi costituenti del composto mostravano diverse capacità di assorbimento dei raggi X. In questo modo, l'esperimento ha facilitato il composto NBC-Iod-CBT di interesse per subire l'autoassemblaggio innescato da NTR per formare le nanoparticelle previste (Iod-CBT-NP) in laboratorio.

Formazione intracellulare di Iod-CBT-NP e imaging nano-TC con microscopia a raggi X molli

Zhang et al. successivamente ha studiato lo stesso processo sperimentale per indurre l'autoassemblaggio delle nanoparticelle all'interno delle cellule. Il composto di interesse (NBC-Iod-CBT) aveva una maggiore selettività verso la nitroreduttasi, per prevenire così ogni possibile interferenza intracellulare in presenza di altri costituenti intracellulari come i biotioli, ossidanti e amminoacidi. Le cellule del cancro cervicale umano HeLa tipicamente sovraesprimono la nitroreduttasi (NTR) in condizioni ipossiche (private di adeguati livelli di ossigeno), raggiungendo i massimi livelli sperimentali entro otto ore. Quando Zhang et al. cellule HeLa ipossiche incubate con la piccola molecola NBC-Iod-CBT, hanno osservato l'eventuale formazione di nanoparticelle all'interno delle cellule HeLa ipossiche. Utilizzando immagini al microscopio elettronico delle cellule, hanno mostrato l'esistenza delle nanoparticelle come previsto nel citoplasma cellulare.

Per osservare direttamente le nanoparticelle di interesse (Iod-CBT-NP) all'interno delle cellule, il team ha trattato sperimentalmente le cellule HeLa ipossiche e le ha visualizzate utilizzando la microscopia a raggi X molli nano-CT. Hanno quindi utilizzato cellule HeLa ipossiche pretrattate con dicumarina o normossia (livelli normali di ossigeno) come due controlli positivi e cellule HeLa ipossia o normossia non trattate come due controlli negativi. I risultati hanno indicato la formazione delle nanoparticelle Iod-CBT nel citoplasma delle cellule HeLa ipossiche. Quando hanno sottoposto queste cellule al trattamento con inibitori della nitroreduttasi, il contrasto TC del citoplasma è diminuito. Il team ha ricostruito le proiezioni 2-D delle cellule per ottenere immagini nanoCT 3-D. Utilizzando il coefficiente di assorbimento lineare (LAC) o il coefficiente di attenuazione lineare, Zhang et al. confermato la fattibilità della formazione di nanoparticelle intracellulari.

In questo modo, Miaomiao Zhang e colleghi hanno progettato razionalmente un costrutto NBC-Iod-CBT iodato di piccole molecole per formare e osservare direttamente le nanoparticelle all'interno delle cellule utilizzando la nano-TC. Dopo esperimenti di prima mano condotti in vitro, il team ha condotto ulteriori studi nel citoplasma delle cellule HeLa che esprimono nitroreduttasi. Utilizzando tecniche analitiche, il team ha mostrato la formazione di nanoparticelle (Iod-CBT-NP) nelle cellule ipossiche HeLa trattate con NBC-Iod-CBT. Hanno verificato il loro metodo utilizzando il coefficiente di assorbimento lineare e confermato la fattibilità della formazione di nanoparticelle intracellulari. Questo lavoro aiuterà i ricercatori ad acquisire conoscenze più approfondite sulla formazione di nanostrutture intracellulari con applicazioni significative nella nanomedicina e nella bioingegneria.

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