Meccanismi di determinazione della capacità di carico utile e distribuzione degli LNP di mRNA dal contenuto di PEG. a, b I processi di assemblaggio ipotizzati e le caratteristiche della formulazione di LNP con un'elevata concentrazione di PEG mol% (a); o una bassa concentrazione di PEG mol% (b) e la composizione si sposta durante la dialisi da pH 4,0 (a sinistra) a pH 7,4 (a destra). Le frazioni di popolazione etichettate sono dati reali dalla formulazione con PEG mol% = 1,5% (a) o 0,5% (b). a Ogni etichetta numerica rappresenta un comportamento della popolazione durante la dialisi:1, suddivisione di LNP vuoti; 2, stabilizzazione di LNP vuoti; 3, scissione di complessi lipofili con un payload di mRNA inizialmente elevato; 4, rimanendo uno stesso payload di mRNA per complessi lipofili con un payload inizialmente basso o intermedio; 5, fusione di LNP vuoti con complessi di mRNA; 6, fusione di complessi non lipofili. Il segno a croce rappresenta la scoperta che il carico utile di mRNA dei complessi lipofili non aumenta durante la dialisi a causa della mancanza di fusione in questa condizione. b Le etichette sono:1, fondono tra complessi lipofili; 2, unione di LNP vuoti con complessi di mRNA; 3, fusione di complessi non lipofili; 4, suddivisione di LNP vuoti. Credito:Comunicazioni sulla natura (2022). DOI:10.1038/s41467-022-33157-4
Una componente importante dei vaccini che proteggono le persone contro il virus SARS-CoV-2 e le sue varianti sono le nanoparticelle lipidiche o LNP. Queste particelle circolari trasportano carichi utili di mRNA terapeutici, i frammenti di materiale genetico che attivano il nostro sistema immunitario per difendersi dal COVID-19.
Anche con il loro successo, alcune caratteristiche delle particelle, come la distribuzione del carico utile, sono sconosciute. I ricercatori e la Food and Drug Administration desiderano maggiori informazioni su queste caratteristiche per migliorare i rapporti sulle metriche nella produzione farmaceutica.
Una nuova piattaforma di rilevamento molecolare sviluppata da due professori della Whiting School of Engineering sta rispondendo all'appello della FDA. Hai-Quan Mao e Tza-Huei (Jeff) Wang vogliono esaminare quante molecole di mRNA può trasportare un LNP e se l'mRNA è imballato uniformemente all'interno della particella per aiutare i ricercatori a progettare trattamenti e vaccini più efficienti ed efficaci.
"La nostra piattaforma elabora le molecole a livello di singola nanoparticella, ma a differenza degli attuali metodi di imaging per gli LNP di mRNA, il nostro approccio si basa sulla spettroscopia fluorescente e ci dà la capacità di vedere attraverso le particelle", ha affermato Wang, professore nei dipartimenti di meccanica Ingegneria e ingegneria biomedica presso la Whiting School e ricercatore principale presso l'Institute for NanoBioTechnology.
La capacità di scrutare all'interno delle nanoparticelle consente ai ricercatori di differenziare e misurare LNP vuoti che non contengono mRNA, LNP con mRNA e mRNA fluttuante in un campione.
La loro piattaforma, chiamata spettroscopia confocale a illuminazione cilindrica, o CISC, funziona etichettando i componenti mRNA e LNP con segnali fluorescenti fino a tre colori e facendo passare il campione attraverso un piano di rilevamento. Il piano di rilevamento legge i segnali fluorescenti e ne misura l'intensità prima di confrontare la forza delle intensità con quella di una singola molecola di mRNA.
L'analisi dei dati con un algoritmo chiamato deconvoluzione dice al team sia quante copie di mRNA ci sono all'interno dell'LNP, se presenti, sia la loro distribuzione nel campione. La piattaforma del team supera i limiti di contrasto e aumenta il throughput dell'analisi del campione, che si vede nella microscopia elettronica a criotrasmissione, l'attuale gold standard per l'imaging degli LNP di mRNA.
I test condotti utilizzando questa piattaforma di rilevamento hanno rivelato che da una soluzione di riferimento di mRNA LNP utilizzata negli studi di ricerca accademica, oltre il 50% degli LNP non è caricato con molecole di mRNA e degli LNP riempiti di mRNA, la maggior parte conteneva da due a tre mRNA molecole per particella.
"Essere in grado di risolvere quantitativamente le caratteristiche del carico utile degli LNP di mRNA a livello di singola particella non è mai stato fatto prima. Siamo incuriositi dalla presenza sostanziale di LNP vuoti e, alterando le condizioni di formulazione, una singola nanoparticella può caricare da un minimo di uno a un massimo di fino a dieci molecole di mRNA", ha affermato Mao, professore nei dipartimenti di Scienza e Ingegneria dei Materiali e Ingegneria Biomedica presso la Whiting School e direttore dell'Institute for NanoBioTechnology.
I risultati del team sono pubblicati in Nature Communications .
"Ci sono molti gruppi che fanno ricerca sull'LNP", ha detto Wang. "Tuttavia, quando scoprono una formula che potrebbe funzionare bene, è stato difficile associare quelle scoperte alla composizione e alla distribuzione del carico utile delle nanoparticelle. Con questa piattaforma possiamo fornire una comprensione più completa di ciò che sta accadendo alla singola particella livello."
Sono necessarie ulteriori ricerche per sapere quante molecole di mRNA per capsula di LNP sono ottimali per il trattamento più efficace. Tuttavia, gli LNP vuoti rivelati dalla nuova piattaforma mostrano che è necessario migliorare i metodi per confezionare l'mRNA all'interno degli LNP.
Mao e Wang affermano che la loro piattaforma mostra che ha il potenziale non solo per essere utilizzata in tutte le fasi della ricerca e dello sviluppo relativi all'LNP, ma anche nello sviluppo di altri sistemi di somministrazione di farmaci e misure di controllo della qualità nella fase di produzione. Il team ha depositato una domanda di brevetto sulla tecnica e sta lavorando con i collaboratori per utilizzare la piattaforma per analizzare altri tipi di carichi terapeutici in diversi sistemi di nanoparticelle per il trattamento di diverse malattie.
"La FDA ha recentemente affrontato la necessità di metriche di migliore qualità nella progettazione di nanoparticelle nell'industria farmaceutica", ha affermato Michael J. Mitchell, uno dei principali scienziati nel campo della ricerca LNP e assistente professore di innovazione di Skirkanich presso il Dipartimento di Bioingegneria dell'Università della Pennsylvania.
"Ciò diventerà sempre più importante man mano che la tecnologia mRNA LNP si espande oltre i vaccini in nuove terapie che vengono somministrate nel flusso sanguigno, che hanno requisiti molto severi. La nuova piattaforma di rilevamento sviluppata dai dottori Mao e dal team di Wang è un passo avanti potenzialmente importante nell'affrontare esigenze nella fase di ricerca e regolamentazione e può potenzialmente aiutare nello sviluppo della tecnologia LNP mRNA oltre i vaccini". + Esplora ulteriormente
