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All'interno di una cellula vivente, le proteine e le altre molecole sono spesso strettamente legate insieme. Questi densi ammassi possono essere difficili da immaginare perché le etichette fluorescenti utilizzate per renderli visibili non possono incastrarsi tra le molecole.
I ricercatori del MIT hanno ora sviluppato un nuovo modo per superare questa limitazione e rendere visibili quelle molecole "invisibili". La loro tecnica consente loro di "spollare" le molecole espandendo un campione di cellule o tessuti prima di etichettare le molecole, il che rende le molecole più accessibili ai tag fluorescenti.
Questo metodo, che si basa su una tecnica ampiamente utilizzata nota come microscopia ad espansione precedentemente sviluppata al MIT, dovrebbe consentire agli scienziati di visualizzare molecole e strutture cellulari che non sono mai state viste prima.
"Sta diventando chiaro che il processo di espansione rivelerà molte nuove scoperte biologiche. Se biologi e clinici hanno studiato una proteina nel cervello o un altro campione biologico, e lo stanno etichettando in modo regolare, potrebbero perdere intere categorie di fenomeni ", afferma Edward Boyden, professore di neurotecnologia Y. Eva Tan, professore di ingegneria biologica e scienze cerebrali e cognitive al MIT, ricercatore dell'Howard Hughes Medical Institute e membro del McGovern Institute for Brain Research e del Koch Institute for Integrative del MIT. Ricerca sul cancro.
Usando questa tecnica, Boyden e i suoi colleghi hanno dimostrato di poter visualizzare una nanostruttura trovata nelle sinapsi dei neuroni. Hanno anche ripreso la struttura delle placche di beta-amiloide legate all'Alzheimer in modo più dettagliato di quanto fosse possibile prima.
"La nostra tecnologia, che abbiamo chiamato espansione rivelatrice, consente la visualizzazione di queste nanostrutture, che in precedenza erano rimaste nascoste, utilizzando hardware facilmente disponibile nei laboratori accademici", afferma Deblina Sarkar, assistente professore presso il Media Lab e uno degli autori principali dello studio .
Gli autori senior dello studio sono Boyden; Li-Huei Tsai, direttore del Picower Institute for Learning and Memory del MIT; e Thomas Blanpied, professore di fisiologia all'Università del Maryland. Altri autori principali includono Jinyoung Kang, un post-dottorato del MIT, e Asmamaw Wassie, un recente dottorato di ricerca del MIT. destinatario. Lo studio appare oggi in Nature Biomedical Engineering .
De-crowing
L'imaging di una specifica proteina o altra molecola all'interno di una cellula richiede l'etichettatura con un tag fluorescente trasportato da un anticorpo che si lega al bersaglio. Gli anticorpi sono lunghi circa 10 nanometri, mentre le tipiche proteine cellulari hanno solitamente un diametro compreso tra 2 e 5 nanometri, quindi se le proteine bersaglio sono troppo dense, gli anticorpi non possono raggiungerle.
Questo è stato un ostacolo all'imaging tradizionale e anche alla versione originale della microscopia ad espansione, che Boyden ha sviluppato per la prima volta nel 2015. Nella versione originale della microscopia ad espansione, i ricercatori hanno applicato etichette fluorescenti alle molecole di interesse prima che espandessero il tessuto. L'etichettatura è stata eseguita prima, in parte perché i ricercatori hanno dovuto utilizzare un enzima per tagliare le proteine nel campione in modo che il tessuto potesse essere espanso. Ciò significava che le proteine non potevano essere etichettate dopo l'espansione del tessuto.
Per superare questo ostacolo, i ricercatori hanno dovuto trovare un modo per espandere il tessuto lasciando intatte le proteine. Hanno usato il calore invece degli enzimi per ammorbidire il tessuto, permettendo al tessuto di espandersi di 20 volte senza essere distrutto. Quindi, le proteine separate potrebbero essere etichettate con tag fluorescenti dopo l'espansione.
Con così tante altre proteine accessibili per l'etichettatura, i ricercatori sono stati in grado di identificare minuscole strutture cellulari all'interno delle sinapsi, le connessioni tra i neuroni che sono densamente ricchi di proteine. Hanno etichettato e immaginato sette diverse proteine sinaptiche, che hanno permesso loro di visualizzare, in dettaglio, "nanocolonne" costituite da canali del calcio allineati con altre proteine sinaptiche. Queste nanocolonne, che si ritiene contribuiscano a rendere più efficiente la comunicazione sinaptica, sono state scoperte per la prima volta dal laboratorio di Blanpied nel 2016.
"Questa tecnologia può essere utilizzata per rispondere a molte domande biologiche sulla disfunzione delle proteine sinaptiche, che sono coinvolte nelle malattie neurodegenerative", afferma Kang. "Finora non esisteva uno strumento per visualizzare molto bene le sinapsi."
Nuovi modelli
I ricercatori hanno anche utilizzato la loro nuova tecnica per visualizzare l'amiloide beta, un peptide che forma placche nel cervello dei malati di Alzheimer. Usando il tessuto cerebrale dei topi, i ricercatori hanno scoperto che l'amiloide-beta forma nanocluster periodici, che non erano mai stati visti prima. Questi gruppi di beta amiloide includono anche i canali del potassio. I ricercatori hanno anche trovato molecole di beta amiloide che formavano strutture elicoidali lungo gli assoni.
"In questo articolo, non speculiamo su cosa potrebbe significare quella biologia, ma dimostriamo che esiste. Questo è solo un esempio dei nuovi modelli che possiamo vedere", afferma Margaret Schroeder, una studentessa laureata del MIT che è anche un autore del documento.
Sarkar afferma di essere affascinata dai modelli biomolecolari su scala nanometrica che questa tecnologia svela. "Con un background in nanoelettronica, ho sviluppato chip elettronici che richiedono un allineamento estremamente preciso, nel nanofab. Ma quando vedo che nel nostro cervello Madre Natura ha organizzato biomolecole con una precisione su scala nanometrica, mi fa davvero impazzire", dice.
Boyden e i membri del suo gruppo stanno ora lavorando con altri laboratori per studiare le strutture cellulari come gli aggregati proteici legati al Parkinson e ad altre malattie. In altri progetti stanno studiando i patogeni che infettano le cellule e le molecole coinvolte nell'invecchiamento nel cervello. I risultati preliminari di questi studi hanno anche rivelato nuove strutture, afferma Boyden.
"Di volta in volta, vedi cose davvero scioccanti", dice. "Ci mostra quanto ci manca con la colorazione classica non espansa."
I ricercatori stanno anche lavorando per modificare la tecnica in modo da poter visualizzare fino a 20 proteine alla volta. Stanno anche lavorando per adattare il loro processo in modo che possa essere utilizzato su campioni di tessuto umano.
Sarkar e il suo team, d'altra parte, stanno sviluppando minuscoli dispositivi nanoelettronici alimentati senza fili che potrebbero essere distribuiti nel cervello. Hanno in programma di integrare questi dispositivi con l'espansione che rivela. "Questo può combinare l'intelligenza della nanoelettronica con l'abilità della nanoscopia della tecnologia di espansione, per una comprensione funzionale e strutturale integrata del cervello", afferma Sarkar. + Esplora ulteriormente
